作者：王巧，许磊，冯超，杨维，李德强，张维，张兰桐

【摘要】  　　目的建立金莲花药材的HPLC指纹图谱分析方法，对不同来源的金莲花药材进行分析。方法色谱柱为Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，检测波长200 nm，流动相为乙腈-0.05%磷酸水梯度洗脱，流速1.0 ml/min，记录色谱图50 min。采用直观分析和相似度软件评价金莲花药材质量。结果11批金莲花药材相似度较高，色谱峰强度是不同药材的主要差别，共有20个共有峰，其中两个主要共有特征色谱峰为荭草素-2''-O-β-L-半乳糖苷和荭草苷。结论所建立的指纹图谱分析方法特征性强，为金莲花药材的质量控制提供了依据。

【关键词】  金莲花　 指纹图谱　高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo establish HPLC fingerprints of Flos Trollii Chinensis and to evaluate quality of different Flos Trollii Chinensis samples. MethodsA Zorbax SB-C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μm) was used, the mobile phase consisted of acetonitrile and 0.05% phosphoric acid with gradient elution, the flow rate was 1.0 ml/min, the column temperature was 30℃, and the detection wavelength was 200 nm. The chromatograms were recorded in 50 min. Visual analysis and the similarity evaluation system were used for samples analysis from diverse habitats.ResultsThe chromatographic profiles of the samples collected from different regions were similar. The major difference resulted from intensity of chromatographic peaks. Twenty common peaks were found and two of them were recognized as orientin-2"-O-β-L-galactopyranosyl and orientin. ConclusionThe developed fingerprint method is of high individuality and specificity and can be applied for quality evaluation of Flos Trollii Chinensis.

　　Key words： Flos Trollii Chinensis;   Fingerprint;   HPLC

    金莲花为毛茛科植物金莲花Trollius chinensis Bunge.的干燥花，始载于《本草纲目拾遗》，谓其“味苦，性寒，无毒”，可“治口疮，喉肿，浮热牙宣，耳疼，目痛”，具有“明目，解岚瘴”的功效。现代药理研究表明，金莲花具有抗菌、抗病毒等活性，已有其多种单味和复方制剂用于临床呼吸道感染和肠道感染［1］。金莲花主要化学成分有黄酮、有机酸、生物碱等［2，3］，目前其质量控制方法多以测定其总黄酮或几种化学成分的含量为主［4，5］。HPLC指纹图谱技术具有整体、宏观、模糊分析的特点，适用于药效物质基础未得到有效阐明的中药材的质量评价。本研究建立金莲花药材的HPLC指纹图谱分析方法，为科学评价其质量提供新依据。

　　1  仪器与试药

    Agilent-1200高效液相色谱仪（在线脱气机，四元泵，自动进样器， PDA检测器）；Agilent chemoffice工作站；SCQ-200超声波清洗器（100 W，25 kHz，上海声谱超声波设备厂），SZ-93 自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。乙腈为色谱纯（美国迪马公司），水为二次重蒸水，其他试剂均为分析纯。荭草素-2''-O-β-L-半乳糖苷和荭草苷对照品均由河北医科大学药学院分离制备，归一化法测定含量大于95.0%。共收集11批金莲花药材。其产地见表1。所有药材均经河北医科大学刘振通高级技师鉴定。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件色谱柱为Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5  μm）（Agilent公司）；流动相乙腈（A）和0.05%磷酸溶液（B）梯度洗脱：0～30 min，3%～28% A，30～50min，28%～50%A，50～55 min，50%～3%A，55～65 min，3%A，记录50 min色谱图；检测波长200 nm，柱温30℃，进样量20 μl。表1  金莲花样品来源（略）

　　2.2  溶液的制备

　　2.2.1  供试品溶液金莲花药材经粉碎，过40目筛。取金莲花药材粉末约0.15 g，精密称定，置50 ml锥形瓶中，加50%甲醇25.00 ml，称重，超声提取30 min，取出，放冷，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，即得供试品溶液。

　　2.2.2  对照品溶液分别称取荭草素-2''-O-β-L-半乳糖苷和荭草苷对照品适量，用甲醇溶解，分别制成一定浓度的对照品溶液，备用。

　　2.3  方法学考察

　　2.3.1  精密度实验取金莲花药材供试品溶液，连续进样6次，各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.08%，相对峰面积RSD均小于1.70%，表明方法精密度良好。

　　2.3.2  重复性实验取同一批金莲花药材6份，制备供试品溶液，各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.12%，相对峰面积比值RSD均小于2.72%，表明方法重复性良好。

　　2.3.3  稳定性实验取金莲花药材供试品溶液分别于0，2，4，8，12和24 h 进样分析，各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.26%，相对峰面积RSD均小于1.03%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

　　2.4  金莲花药材HPLC指纹图谱测定与分析取金莲花药材粉末（1～11号样品），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，各取20 μl分别进样，进行HPLC分析，得到各金莲花药材的指纹图谱。其中保留时间稳定的共有峰有20个，保留时间分别为：7.07，7.84，9.34，10.07，10.79，13.62，14.51，17.30，18.04，19.14，21.06，22.09，22.96，23.43，24.19，27.35，33.49，33.39，36.07，38.27 min。

    在相同色谱条件下，以色谱保留时间和紫外扫描图谱为比较参数，将金莲花指纹图谱与各对照品溶液进行比较，指认了指纹图谱中18.04 min和22.09 min 的峰分别为荭草素-2''-O-β-L-半乳糖苷和荭草苷。对照品和典型样品色谱图见图1～2。

    为避免图谱直观分析的主观性对分析结果的影响，采用“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”（版本2004A）进行了数据处理，各图谱进行自动匹配，时间窗宽度为0.3 min，中位数法生成对照谱图，计算12个药材的相似度。相似度计算结果见表2，各样品叠加色谱图见图3。

　　3  讨论

    比较11批药材的指纹图谱可知，除了色谱峰A、B和C外，各批药材色谱图在色谱峰形状和数目上相近，主要是峰强度差别明显（见图3）。No.1～3均为承德产药材，与其他药材明显的色谱峰差别为色谱峰A和B，即No.1～3药材中均有色谱峰B，未检测到色谱峰A，而在其他药材中则相反。这是否是承德产金莲花药材的特征，有待检测大批样品进行确证。另外，仅在No.6内蒙古产金莲花药材中检出峰C，但经相似度比较，该批药材与其他药材的相似度均在0.8以上，而且与对照图谱的相似度为0.930，说明该色谱峰对药材质量的评判影响不明显。表2  11批金莲花药材相似度计算结果（略）

　　由相似度结果可知，除No.1与No.4，No.4与No.7，No.3与No.7药材色谱图之间的相似度小于0.75外，其他药材之间的相似度均大于0.8，说明11批药材之间的相似性较高。各药材图谱与对照图谱之间的相似度均大于0.89，说明所建立的指纹图谱一定程度上可反映金莲花的药材特征。本试验中收集了3批承德产药材，该3批药材之间的相似度均大于0.9，表明同一产地的金莲花药材之间具有较高的相似性，因此固定药材产地可为药材和制剂质量的稳定性提供可靠保证。
   
　　提取方式、溶剂和时间的选择：比较了两种常用的提取方法回流提取法和超声提取法，选择了简便易行、提取效率高的超声提取法。考察了不同提取时间（15，30，45，60 min）和不同提取溶剂（纯水，25%，50%，75%，100%甲醇和乙醇）的影响，确定50%甲醇超声30 min提取效率最佳。

    色谱条件的优化：通过PDA检测器，对色谱峰在200～400 nm进行波长扫描，最终选择色谱峰数目较多且各待测组分都有较好响应的200 nm作为检测波长。为达到指纹图谱最佳分离效果，对不同组成的流动相系统进行了梯度洗脱试验，表明未加酸的流动相对金莲花中化学成分的洗脱能力不理想，因此，需要在流动相中加入一定量的酸。使用乙腈-0.05%磷酸水流动相进行梯度洗脱，各峰分离较好，保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移，有利于指纹图谱的分析。对不同型号，不同长度的C18色谱柱进行比较，表明Zorbax SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5  μm）可使各色谱峰基本达到基线分离，且分析时间短。柱温对分离也有影响，为缩短分离时间，同时考虑到分离效果和色谱柱使用寿命，确定于30℃柱温进行分析。
   
　　本研究建立了金莲花药材的HPLC指纹图谱分析方法，可有效反映金莲花药材的化学特征，为确保其质量提供了新的手段。

【参考文献】
  　　［1］叶云峰，彭 勇，付 岗，等.药用金莲花研究新进展［J］.中国现代中药，2007,9(3):29.

　　［2］宋冬梅，孙启时.金莲花属植物研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2005,22(3):231.

　　［3］辛春兰，潘海峰.金莲花的研究进展［J］.承德医学院学报,2003,20(4):348.

　　［4］沈洪宽，刘艳新，王 力.金莲花质量标准研究［J］.黑龙江医药科学，2007,30(1):62.

　　［5］李小芩，张凤霞，刘惠平，等.反相高效液相色谱法同时测定金莲花中4种黄酮类化合物的含量［J］.药物分析，2007,27(11):1683.