1 材料与仪器

　　1.1 试药氯化两面针碱标准品( 中国 药品生物制品检定所);四噻唑蓝(MTT)(Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);DMEM(美国GIBCOBRL公司);胎生牛血清(杭州四季青生物材料研究所公司);胰蛋白酶(美国Amresco公司公司);谷氨酰胺(美国Amresco公司);PBS(美国Amresco公司);注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司);注射用硫酸链霉素(大连美罗大药厂);HEPES(Sigma公司)。

　　1.2 仪器二氧化碳培养箱(美国Forma Scientific公司);倒置显微镜(日本Olympus公司);酶标仪(芬兰thermo公司);超低温冰箱(日本三洋公司);96孔培养板(美国BIO-RAD公司);6孔培养板(美国BIO-RAD公司);超净工作台(苏州净化设备厂);台式离心机(上海安亭 科学 仪器厂);电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂)。

　　1.3 细胞株人胚肾细胞293细胞株(南京凯基生物科技 发展 有限公司)。

　 　2 方法

　　2.1 DMEM培养液的配置DMEM培养干粉以1 000 ml三蒸水充分溶解，加入NaHCO3 2.0 g, HEPES 4.766 g，加入青霉素、链霉素使其终浓度为100 U·ml-1， 在超净工作台中过虑除菌，分装成90 ml/瓶，-20℃保存备用，临用前加10 ml热灭活(56℃，30 min)胎牛血清。

　　2.2 梯度氯化两面针碱的制备精密称定氯化两面针碱标准品适量用DMSO溶解后，用无血清培养液依次稀释，配置成0.781 25，1.562 5，3.125，6.25，12.5 μg/ml浓度梯度的氯化两面针碱系列浓度样品，置于4℃冰箱中保存备用。

　　2.3 细胞培养人正常胚肾细胞293分别培养于含DMEM完全培养液的玻璃培养瓶中，置于37℃，饱和湿度，5%CO2的培养箱中，定期观察更换培养液。细胞铺满培养瓶底部时传代，用PBS冲洗两次，加入0.25%胰蛋白酶 2 ml消化液，置37℃约1 min，倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞间连接消失，表明此时细胞消化适度，吸取上清液，加入完全培养液2 ml，反复吹打，将细胞吹打均匀，调整培养瓶中细胞浓度至1×105/ml,加入完全培养液，置于CO2的培养箱。实验中所用细胞均处于对数生长期，活细胞数大于95%。

　　2.4 氯化两面针碱的肾毒性实验(MTT法)取对数生长期的人正常胚肾细胞293用胰酶消化后，用DMEM培养液吹打制成细胞悬液加入96孔培养板，每孔190 μl，在5%CO2、37℃培养箱培养24 h待细胞完全贴壁后，受试孔加入系列浓度受试药物10 μl每药3孔，阴性对照孔加入含0.5%DMSO的无血清培养基10 μl，空白对照孔加入等量的含药无血清培养基而无细胞，各孔加培养基至200 μl，培养箱孵育24，48，72 h，加入5 mg/ml的MTT10 μl，继续在培养箱培养4 h，取出96孔板顷去上清液，加入DMSO每孔150 μl，在摇床上振动摇匀10 min，在酶标仪570 nm和630 nm的波长下测得各孔OD值。按下式 计算 药物对293细胞的抑制率。

　　抑制率(%)=对照组OD值-实验组OD值对照组OD值×100%

　　实验重复3次，计算平均抑制率。

　　2.5 SOD，MDA，LDH的测定(紫外分光光度法)取对数生长期的人正常胚肾细胞293用胰酶消化后，用DMEM培养液吹打制成细胞悬液加入6孔培养板，每孔1.9 ml，在5%CO2，37℃培养箱培养24h待细胞完全贴壁后，实验孔加入3.125 μg/ml氯化两面针碱0.1 ml，另设空白对照组。在药物作用的12，24，48 h后，取培养液的上清液按SOD，MDA，LDH试剂盒中所述方法进行SOD，MDA，LDH的测定。

　　2.6 统计学软件处理数据数据以±s表示，组间的均数采用方差分析进行两两比较，采用SPSS13.0软件进行处理。采用Bliss法 计算 IC50值。

　 　3 结果

　　3.1 MTT测定结果药物干预组与空白对照组比较，在0.78125～12.5 μg/ml浓度范围内，吸收度A值随药物浓度的增加逐渐减小，说明氯化两面针碱对人正常胚肾细胞293有一定的毒性作用，且随氯化两面针碱浓度的增大对细胞的毒性增加。结果见表1。表1 MTT法测定氯化两面针碱对293细胞株的毒性作用本文由中国论文联盟理学 资料对于后续研究有着重要的指导意义，因此建立一个良好的实验模型检测药物毒性对于新药的研究与开发具有重要意义。肾为人体重要的代谢器官，所以考察一个药物的毒性大小以肾细胞为对象具有代表性作用。肾毒性检测是研究新化合物毒理学的重要组成部分，而通过体外肾细胞模型进行新化合物的肾毒性研究更是有着自身的众多优点。本实验中，我们选取了人胚肾细胞293为实验对象，考察氯化两面针碱对正常细胞的毒性作用。

　　通过测定加入药物作用后的6孔板中培养上清液的SOD，MDA，

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