|
【摘要】 初步评价自行设计构建的仿生髓核组织工程支架材料－CHCS支架的在体组织性能。［方法］以单层培养的传1代髓核细胞为种子细胞，体外初步构建细胞－CHCS支架复合体，并植入摘除髓核的椎间盘内，观察椎间隙的高度、相应节段生物力学性能以及组织学改变。［结果］成功构建了细胞－CHCS支架复合体，植入摘除髓核的椎间盘内，髓核细胞能够成功地合成和分泌PG等细胞外基质。在12周时，细胞－支架复合体初步形成了解剖学上的髓核样结构。8周后能有效缓解椎间隙高度的下降和抗压、屈曲、伸直强度的降低。［结论］所构建的细胞－支架复合体对于椎间盘的退变有一定的延缓作用。同时表明所构建的CHCS支架具有良好的在体组织性能。
【关键词】 组织工程 椎间盘 支架 生物力学
Abstract: ［Objective］To examine the performance of CHCS scaffold for nucleus pulposus tissue engineering in vivo. ［Method］P1 nucleus pulposus cells cultured in vitro were harvested, and then seeded into the CHCS scaffolds to engineer nucleus pulposus-like matrix. After it was cultured for 7 days, the cell-seeded CHCS scaffold was implanted into the disc space, in which nucleus pulposus was cut out.The disc space was calculated, the compression、flexion and extension strength were examined, the histological changes were observed. ［Result］The cell-seeded CHCS scaffold had produced PG in vivo. After 12 weeks, the nucleus pulposus-like tissue had been observed in the operated disc. After 8 weeks, the reductions of the disc space and the biomechanics of the experimental FSU were slowed down. ［Conclusion］The implanted cell-seeded CHCS scaffolds can slow the progress of discs degenerating. It means the CHCS scaffold has showed good performance in vivo.
Key words：tissue engineering; intervertebral disc; scaffold; biomechanics
下腰痛是现代社会中一种常见病和多发病，作为仅次于上呼吸道感染的疾病，是导致劳动力丧失的主要原因之一［1］。腰椎间盘突出症等椎间盘退行性变是引起下腰痛最常见的原因。研究开发符合椎间盘和（或）髓核结构与功能的移植物，对退变椎间盘进行功能重建，已成为治疗退行性椎间盘疾病比较理想的解决方案。近年来组织工程学技术的迅速发展，为体外构建理想的椎间盘组织创造了极其有利的条件并提供了可能。采用组织工程学技术构建椎间盘的研究目前国外尚处于起步阶段，国内未见报道。目前文献报道中应用于组织工程化髓核的细胞支架基本来源于骨或软骨组织工程的生物材料。文献中尚未报道髓核组织工程设计构建的专用支架材料，因此探索构建理想的细胞支架，成为髓核组织工程研究的重点和难点之一。为此，作者采用髓核组织细胞外基质主要成分，包括II型胶原、6-硫酸软骨素、透明质酸等，设计和构建了仿生髓核组织工程支架材料－CHCS支架，并对其理化性能［2］、免疫原性［3］及细胞相容性［4］进行了研究，表明该支架材料就前述研究内容而言具有良好的性能，可进行深入的研究。本实验在此基础上，观测了CHCS支架材料的在体组织性能。
1 材料与方法
1.1 髓核细胞的体外分离、培养
3周龄乳兔（第三军医大学实验动物中心提供）。取材及髓核细胞的体外分离和培养方法参照本室已建立的方法和培养体系［5］。
1.2 CHCS支架材料的制备
将先前已制备的支架材料［2］裁剪成1 cm×1 cm×0.5 cm大小，共35块，60Co照射消毒72 h，备用。
1.3 组织工程化髓核的体外初步构建
无菌条件下将支架材料放置到6孔培养板中，加入人纤维蛋白原液体中 (终浓度为2 mg/ml)孵育30 min，吸去多余液体，静置4 h。将已达80%融合的原代培养髓核细胞，以0.25%胰蛋白酶消化、离心，用DMEM/F12 (pH 7.0)混悬细胞，计数制成含细胞2×105的细胞悬液。按1∶2∶7比例混合50 mmol/L CaCl2、凝血酶20 U/ml细胞悬液。将混合物滴加至支架材料内，静置30 min。然后加培养液 (含15% FBS的DMEM/F12, pH 7.4)至2 ml，置于37℃、5% CO2温箱中培养。每2 d换液一次，每日倒置显微镜观察，7 d后吸尽培养液，取其中5个细胞－支架复合体，用5%戊二醛－锇酸固定包埋切片后扫描电镜观察。其余复合体行动物实验。
1.4 动物实验
1.4.1 动物分组
成年新西兰大耳白兔，雌雄各半，体重2.0～2.5 kg。随机分为3组：正常组10只；对照组30只；实验组30只。
1.4.2 动物实验
实验组及对照组动物称重，以3%戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉成功后，摘除 L5、6椎间盘的髓核。在手术间隙下位椎体以金属针予以标记。对照组仅摘除髓核。实验组植入细胞－支架复合体。
1.4.3 椎间隙高度变化
实验组及对照组动物分别于术后4 周、8周、12周各取5只，及正常组动物5只，麻醉后在DR机上行侧位照片。由一位放射科技师测量实验节段椎间隙高度及其下位椎体高度(图1)。并以Bradner disc index (BDI)计算椎间隙高度变化。
BDI＝实验节段椎间隙高度（B）/下位椎体高度（A）
1.4.4 生物力学性能测试
前述动物测量椎间隙高度后，取出包括上位椎体、实验椎间盘、下位椎体及其附件结构的脊柱功能单位，-70℃保存。在生物力学试验机上测定其屈曲、后伸、抗压等生物力学性能。
1.4.5 组织学观察
另取实验组、对照组术后4周、8周、12周动物各5只，及正常动物5只，麻醉后完整取出实验节段椎间盘组织 (包括上下终板)，以多聚甲醛固定3 d后，脱钙处理。脱水后石蜡包埋，切片。行HE染色。观察组织学变化。
1.5统计学方法
所得数据采用SPSS 12.0的统计程序，行样本数据正态分布检验和单因素方差分析等。结果以均数±标准差（mean±SD）表示。
2 结果
2.1细胞－支架复合体扫描电镜观察
体外培养7 d，支架网孔结构内可见细胞粘附，呈圆形或类圆形。细胞增殖，簇样生长 (图2)。
2.2椎间隙高度变化（表1、图3）。表1 椎间隙高度变化 (BDI)分组4周8周12周正常组0 从以上数据可以看出：（1）实验组和对照组在各时相点，椎间隙高度较正常组均有非常显著的差异 (P<0.01)。（2）实验组在4周时的椎间隙高度与对照组无显著差异(P>0.05)；而在8周和12周时椎间隙高度均高于对照组 (P<0.05或P<0.01)。（3）对照组在各时相点椎间隙高度呈进行性降低 (P<0.05或P<0.01)，分别降低了19.5%、33.7%和40.6%。（4）实验组分别降低了19.0%、26.1%和31.4%。显示出在4周、8周时椎间隙高度呈进行性降低 (P<0.05或P<0.01)；12周时虽与4周时有非常显著降低(P<0.01)，与8周相比虽有下降趋势，但统计学上已无差异 (P>0.05)。实验结果表明：（1）实验组与对照组术后椎间高度均显著丢失；（2）所构建的细胞-支架复合体移植后在缓解椎间隙高度降低方面有一定的作用，这种作用随时间的延伸有更明显趋势（图3）。 2.3 生物力学变化
2.3.1 椎间盘抗压强度变化（表2）。 表2 椎间盘抗压强度变化结果显示：（1）实验组及对照组在各时相点其抗压强度均非常显著低于正常组(P<0.01)；（2）对照组在各时相点其抗压强度呈进行性降低 (P<0.01)；（3）实验组8周和12周时抗压强度较4周时有显著或非常显著下降 (P<0.05或P<0.01)，8周和12周相比无统计学差异 (P>0.05)；（4）实验组与对照组相比除在4周时无统计学差异 (P>0.05)外，在8周和12周时均显著或非常显著地高于对照组 (P<0.05或P<0.01)。表明：（1）实验组与对照组术后椎间盘抗压强度均显著降低；（2）植入的细胞－支架复合体在8周后能够有效地缓解椎间盘抗压强度的降低程度，且随时间的延伸有更明显趋势。
2.3.2 椎间盘屈曲强度变化（表3）。
结果显示：（1）实验组及对照组在各时相点其屈曲强度均非常显著低于正常组(P<0.01)；（2）对照组在各时相点其屈曲强度呈进行性降低(P<0.01)；（3）实验组8周和12周时屈曲强度较4周时有非常显著下降 (P<0.01)，8周和12周相比无统计学差异(P>0.05)；（4）实验组与对照组相比除在4周时无统计学差异 (P>0.05)外，在8周和12周时均显著地高于对照组 (P<0.05)。表明：（1）实验组与对照组术后椎间盘屈曲强度均显著降低；（2）植入的细胞－支架复合体在8周后能够有效地改善椎间盘屈曲强度的降低程度，且随时间的延伸有更明显趋势。表3 椎间盘屈曲强度变化(N)分组4周8周12周正常 *： P<0.01，vs 4周；﹟：P<0.05，vs 8周
2.3.3 椎间盘伸直强度变化（表4）。
结果显示：（1）实验组及对照组在各时相点其伸直强度均非常显著低于正常组(P<0.01)；（2）对照组在各时相点其伸直强度呈进行性降低 (P<0.01)；（3）实验组8周和12周时伸直强度较4周时非常显著下降 (P<0.01)，8周和12周相比无统计学差异(P>0.05)；（4）实验组与对照组相比除在4周时无统计学差异 (P>0.05)外，在8周和12周时均显著地高于对照组 (P<0.05)。表明：（1）实验组与对照组术后椎间盘伸直强度均显著降低；（2）植入的细胞－支架复合体在8周后能够有效地减缓椎间盘伸直强度的降低，且随时间的延伸有更明显趋势。表4 椎间盘伸直强度变化(N)分组4周8周12周正常组
2.4 组织学观察
正常兔椎间盘髓核组织内可见髓核细胞呈圆形或类圆形。数量少，细胞周围有大量的细胞外基质成分堆积。对照组在12周时椎间盘内原髓核位置空虚，未见髓核组织再生。实验组12周的组织学切片可见椎间盘内细胞-支架复合体移植部位初步形成了髓核样结构，细胞形态与生理髓核中细胞形态接近，但数量明显多于正常髓核组织。细胞周围有较多的细胞外基质合成、分泌和堆积，但较正常髓核细胞外基质仍偏少 (图4)。 图1椎间盘高度测量方法(BDI指数)
3 讨论
近年来，应用MRI研究椎间盘退变表明，随着年龄的增长，椎间盘退变悄然无声的发生，并且是不可逆转的过程［6、7］。另外，随着年龄的增长，椎间隙逐渐变窄，髓核中的水分逐渐减少。髓核从退变纤维环的破裂处突出，从而发生椎间盘突出。髓核摘除术可以加速椎间盘的退变。其他微创术式，如经皮髓核吸除术、经皮激光椎间盘减压等，同样可以加速椎间盘的退变。
在预防和治疗椎间盘退变的基础研究中，Nishimura和Mochida［8］将新鲜或冷冻的髓核植入大鼠尾椎间盘突出模型的椎间隙内，发现植入的髓核可以延缓椎间盘退变的进程。Okuma等［9］将髓核植入兔椎间隙内也取得了相同的实验结果。Gruber等［10］在沙鼠模型中发现植入自体椎间盘细胞可减缓椎间盘损伤所致的椎间盘退变。Nomara等［11］发现植入异体椎间盘细胞同样可减缓兔椎间盘退变的进程。Nishida等［12、13］以腺病毒作为载体，将TGF-β1基因转染兔髓核细胞，扩增后植入兔退变的椎间盘内时发现，携带TGF-β1基因的兔髓核细胞能有效地改善兔椎间盘退变的进程。Sato等［14］将培养的兔椎间盘纤维环细胞种植于ACHMS支架内，构建细胞－支架复合体，支架周围用薄膜包绕封闭，培养1周后将其移植于已被激光汽化切除髓核的兔椎间盘内。术后2、4、8、12周摄腰椎X线片并测量其椎间盘高度，并取出部分标本行组织学检查，结果显示：空白对照组仅有少量的小细胞出现在椎间盘的空隙内；单纯支架髓核内移植组，可见有内源性髓核细胞迁移进入支架内，并且沙番红-O染色呈弱阳性。但来自于内源性髓核细胞所产生的细胞外基质并不能完全充满支架的有效空间内；单纯支架纤维环内移植组，在支架周围可见疤痕组织形成，有少量小细胞生长，沙番红-O染色呈弱阳性；而在细胞－支架复合体髓核内移植组，可见纤维环细胞在支架内增殖，沙番红-O染色呈强阳性；细胞－支架复合体纤维环内移植组，在支架内外均沉积大量的软骨样细胞外基质，沙番红-O染色呈强阳性，形成了软骨样组织。在组织学表现上类似于正常的纤维环组织。实验结果表明，培养的同种异体纤维环细胞移植后能存活，并且具有增殖能力，并合成和分泌细胞外基质，形成类似纤维环样结构。术后12周X线片显示，移植细胞-支架复合体能有效地防止椎间隙的进一步狭窄，延缓了椎间盘的退变。Sakai［15］等将兔自体骨髓间充质干细胞经分离培养后作为种子细胞与胶原凝胶复合，植入兔退变的椎间隙，发现骨髓间充质干细胞在体内环境下能转化为类软骨细胞表型，产生Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，有效地延缓了椎间隙的退变。这些研究成果为体外构建组织工程化髓核治疗椎间盘退变提供了理论和实验依据。
在组织工程化椎间盘研究中，在体实验是研究组织工程技术的重要实验内容之一。本课题采用双相接种法，将体外培养的1代髓核细胞接种于自行设计构建的仿生髓核组织工程支架材料初步构建了细胞－支架复合体。通过电镜观察3 D培养的髓核细胞在支架材料内，呈现为球形。单层培养和3D培养的髓核细胞之所以出现细胞形态的变化是由细胞表型表达所决定的。Glowacki等［16］观测软骨细胞单层培养和3 D培养时细胞形态时发现，单层培养的软骨细胞呈现为成纤维细胞的梭形，表现为快速的生长、脱氧胸腺嘧啶摄入量增加、硫酸盐掺入量降低；而在3 D培养中，细胞转化为球形，表现为生长减缓、脱氧胸腺嘧啶摄入量降低、硫酸盐掺入量增加。作者认为，细胞形状是细胞表型表达的重要因素。Gruber等［17、18］观察了纤维环细胞单层和3 D培养时细胞形态和生长增殖差异时，也得到了相同的实验结果。作者的实验结果也同样验证了文献的研究结果。同样表明，3 D培养中髓核细胞形态的变化是适应培养的微环境变化，减缓生长增殖速度，增加GAG的合成和分泌，以发挥其生物学功能。
作者将构建的细胞－支架复合体体外培养7 d后，植入摘除髓核的兔椎间盘内，结果发现：髓核细胞能够成功地合成和分泌PG等细胞外基质。在12周时，细胞－支架复合体初步形成了解剖学上的髓核样结构。
椎间盘组织再生的目的不仅要获得解剖学上形态结构，更重要恢复其功能。因此，作者在研究分析了体内髓核细胞－支架复合体的组织学变化的同时，还观测了再生组织的性能。结果显示：植入组在8周、12周时椎间隙高度与对照组相比有显著性差异。植入组12周时，虽然其高度较8周时仍有下降趋势，但已无统计学差异。表明：所构建的细胞－支架复合体能够延缓椎间隙高度的降低，也意味着所构建的复合体对于椎间盘的退变有一定的延缓作用。同时，作者检测了相应节段脊柱的抗压、屈曲、伸直强度等生物力学变化，得到了相同的实验结果。这些实验结果与组织学的变化相一致。进一步表明作者所构建的复合体形成的髓核样组织不仅具有良好的组织学形态，同时也初步显示出其良好的生物学特性。
【参考文献】
［1］ Andersson GB. Epidemiologic aspects on low back pain in industry［J］. Spine, 1981, 6: 53-60.
［2］ 李长青，周跃，张传志.仿生髓核组织工程细胞支架的构建及初步理化指标分析［J］.第三军医大学学报, 2005,27:1351-1354.
［3］ 李长青，周跃.仿生髓核组织工程细胞支架的免疫原性研究［J］.第三军医大学学报, 2005,27:837-840.
［4］ 李长青，周跃，罗刚，张传志.仿生髓核组织工程支架材料对体外培养髓核细胞合成代谢的影响［J］.中国脊柱脊髓杂志，2006，16：450-453.
［5］ 张传志，周跃，李长青.兔髓核细胞体外最佳培养条件的探索［J］.中国矫形外科杂志, 2005, 13:71-74.
［6］ Lipson SJ, Muir H. Experimental intervertebral disc degeneration: morphologic and proteoglycan changes over time［J］.Arthritis Rheum，1981, 24: 12-21.
［7］ Mochida J, Nishimura K, Nomura T, et al. The importance of preserving disc structure in surgical approaches to lumbar disc herniation［J］.Spine,1996, 21: 1556-1563.
［8］ Nishimura K, Mochida J. Percutaneous reinsertion of the nucleus pulposus: an experimental study［J］.Spine,1998,23: 1531-1538.
［9］ Okuma M, Mochida J, Nishimura K, et al. Reinsertion of stimulated nucleus pulposus cells retards intervertebral disc degeneration: an in vitro and in vivo experimental study［J］.J Orthop Res, 2000,18: 988-997.
［10］Gruber HE, Johnson TL, Leslie K, et al. Autologous intervertebral disc cell implantation: a modelusing psammomy sobesus, the sandrat［J］.Spine, 2002, 27: 1626-1633.
［11］Nomura T, Mochida J, Okuma M, et al. Nucleus pulposus allograft retards interverbral disc degeneration［J］.Clin Orthop, 2001, 389: 94-101.
［12］Nishida K, Kang JD, Suh JK, et al. Adenovirus-mediated gene transfer to nucleus pulposus cells: implications for the treatment of intervertebral disc degeneration［J］.Spine,1998,23:2437-2442.
［13］Nishida K, Gilbertson LG, Robbins PD, et al. Potential applications of gene therapy to the treatment of intervertebral disc disorders［J］.Clin Orthop,2000,379:234-241.
［14］Sato M, Asazuma T, Ishihara M, et al. An experimental study of the regeneration of the intervertebral disc with an allograft of cultured annulus fibrosus cells using a tissue-engineering method［J］.Spine,2003, 28: 548-553.
［15］Sakai D, Mochida J, Yamamoto Y, et al. Transplantation of mesenchymal stem cells embedded in atelocollagen gel to the intervertebral disc: a potential therapeutic model for disc degeneration［J］.Biomaterials,2003,24:3531-3541.
［16］Glowacki J, Trepman E, Folkman J. Cell shape and phenotypic expression in chondrocytes［J］.Proc Soc Exp Biol Med, 1983,172:93-98.
［17］Gruber HE, Stasky AA, Hanley EN. Characterization and phenotypic stability of human disc cells in vitro［J］.Matrix Biology，1997,16:285-288.
［18］Gruber HE, Hanley EN. Human disc cells in monolayer vs 3D culture: cell shape, division and matrix formation［J］.BMC Musculoskeletal Disorders, 2001,11: 1471-1477. |
用户登录 
新用户注册 