作者：张海燕，黄穗平，黄绍刚，张向飞，王静  

【摘要】  　　目的探讨清热祛湿法（肠涤清灌肠液灌肠＋肠炎清1号灌胃）对实验性溃疡性结肠炎(UC)大鼠黏膜损伤、血清和结肠组织中SOD活力及MDA含量的影响。方法成年雌性SD大鼠51只，先随机抽取8只大鼠作为正常组，不予造模；剩余的43只大鼠予造模后，第3天随机抽取2只解剖，观察造模是否成功；剩余的41只大鼠随机分为模型组11只，肠涤清组、肠涤清＋肠炎清组、柳氮磺胺吡啶(SASP)组各10只。造模后第4天开始，正常组和模型组给予生理盐水灌肠、其余三组分别给予肠涤清灌肠、肠涤清灌肠＋肠炎清灌胃、SASP灌肠＋灌胃，疗程2周。分别从大鼠的一般状况、结肠黏膜损伤指数及病理形态变化、血清和结肠组织中SOD活力及MDA含量的变化来观察清热祛湿法对2，4，6-三硝基苯磺酸诱导的实验性UC大鼠的作用机制。结果与模型组和其他两个

　　Key words： The method of removing heat and dispersing dampness；  Ulcerative colitis (UC)；  Changyanqing 1；  Changdiqing fluid

    近年来溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）在我国的发病率呈逐渐升高趋势，且被认为是结肠癌的癌前病变，已被世界卫生组织列为现代难治病之一。在临床实践过程中，我们发现活动期UC的病机特点以大肠湿热为主，治疗当以清热祛湿为法。中医药治疗本病具有独特优势，肠涤清灌肠液和肠炎清1号方已在广东省中医院使用近十年，治疗活动期大肠湿热型UC疗效显著。为探讨清热祛湿法(肠涤清灌肠液灌肠加肠炎清1号方灌胃)对UC的作用机理，本实验观察了该方法对实验性UC大鼠黏膜损伤、血清和结肠组织中SOD活力及MDA含量的影响。现报道如下。

　　1  材料与仪器

　　1.1  动物SPF级健康成年雌性SD大鼠51只，体质量为200～230 g。由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(粤)2003-0002，粤监证字2007A003。

　　1.2  药物肠涤清灌肠液：由黄柏30 g，败酱草20 g，大黄20 g，地榆30 g，白及15 g等药物组成。购于广东省中医院，由广东省中医院制剂部煎制，每剂煎150 ml备用，密封保存，温热后灌肠。
   
　　肠炎清1号方：由黄芩10 g，黄连10 g，白头翁15 g，秦皮10g，木香5 g，芍药15 g，蛇舌草20 g，炒当归5 g，元胡15 g，甘草5g等药物组成。购于广东省中医院，由江阴天江药业有限公司制成中药配方颗粒，加开水溶解后配制为含生药1 g/ml溶液，置4℃的冰箱保存备用，温热后灌胃。

    柳氮磺吡啶肠溶片(SASP)：上海三维制药有限公司生产(批文号：国药准字H31020450)，规格：每片0.25 g。用刀片轻轻刮去外层包衣后研为细粉，用蒸馏水配成30 mg/ml的混悬液，置4℃的冰箱保存备用，温热后灌胃及灌肠。

　　1.3  试剂2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）：由美国sigma公司生产，批号为［107K5008］，分子量为：293.2，浓度为5%，购于上海Sigma-Aldrich生物技术有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）测试盒：购于南京建成生物工程研究所，批号：20080412；丙二醛（MDA）测试盒：购于南京建成生物工程研究所，批号：20080524。考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒：购于南京建成生物工程研究所，批号：20080530。

　　1.4 仪器高速离心机：德国sigma公司生产的LD4-2A离心机；组织匀浆机；宁波生物科技有限公司生产的电动玻璃匀浆机；光学显微镜：Motic公司BA200型。分光光度计：UV-7504紫外可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）。

　　2  方法

　　2.1  大鼠分组SPF级健康成年雌性SD大鼠51只，采用架式笼养喂养。先随机抽取8只大鼠作为正常组，不予造模。剩余的43只大鼠予造模后，第3天随机抽取2只解剖，观察造模是否成功；剩余的41只大鼠随机分为4组：模型组（空白组）11只；肠涤清灌肠液灌肠组（简称肠涤清组）、肠涤清灌肠液灌肠＋肠炎清1号灌胃组（简称肠涤清＋肠炎清组）、SASP灌肠＋灌胃组（简称SASP组），每组10只。

　　2.2  造模方法参照参考文献［1］：将大鼠禁食不禁水24 h后，腹腔注射10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3 ml/100 g），固定于鼠解剖台上，将一直径2.0 mm长约11 cm的橡胶输液管，由肛门轻缓插入深约8 cm，给予2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）－乙醇溶液(100 mg/kg TNBS＋50%的乙醇溶液0.25 ml)缓缓注入到大鼠肠腔内，再注入少许空气，提起大鼠尾部，倒置30 s，使造模剂充分渗入大鼠肠腔。让动物保持平躺自然苏醒，各组大鼠苏醒后正常饲养。观察大鼠体重、进食量、饮水量、毛发光泽度、大便性状以及活动情况。

　　2.3 给药方法按照公式：大鼠用药剂量(mg/kg)＝5倍成人用药量(mg/kg)，各组动物在正常饲养的基础上，从造模后第4天开始用药。第1组为正常组：每天定时用生理盐水灌肠，2 ml/200g。第2组为模型组：每天定时用生理盐水灌肠，2 ml/200g。第3组为肠涤清组：每天定时用肠涤清灌肠，2 ml/200 g。第4组为肠涤清＋肠炎清组：每天定时用肠涤清灌肠，2 ml/200 g；肠炎清1号灌胃，2 ml/200 g。第5组为SASP组：每天定时用SASP灌肠，2 ml/200 g；同时配合灌胃，2 ml/200 g。上述用药皆1次/d，治疗均为2周。

　　2.4  取材大鼠禁食不禁水24 h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3 ml/100 g），迅速剖腹，腹主动脉取血2 ml，离心后置-80℃冰箱保存备用。将距肛门12 cm长的末端结肠取出，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冷生理盐水冲洗肠内容物，将黏膜向上展开，肉眼观察黏膜损伤并进行评分，结肠黏膜损伤指数（CMDI）的半定量标准参照 Vilaseca［2］等制定的评分标准（见表1）。再取病变最明显处2 cm左右，放至-20℃冰箱速冻，然后移至-80℃冰箱冷冻保存。最后再留取各组大鼠结肠病变最明显处组织若干，10%福尔马林溶液浸泡固定，以备制作病理切片。表1  结肠黏膜损伤评分标准（略）

　　2.5  检测方法SOD、MDA检测方法严格按照试剂盒说明操作，由广州威佳科技有限公司检测。病理切片由广州中医药大学病理教研室制作。

　　2.6  统计方法统计学处理采用SPSS13.0软件进行分析。数据的一般性分析及统计推断：采用双侧检验，检验水平α＝0.05。所有计量资料均用 ±s表示。若数据符合方差齐性，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；若数据方差不齐，则采用非参数检验方法。两个变量的相关性分析采用非参数Spearman秩相关检验方法。

　　3  结果

　　3.1  一般情况正常组：大鼠活动正常，反应灵活，毛色光润，饮食正常，大便呈颗粒状，无稀便及脓血便。模型组：在造模后的第2天即出现稀烂便，随后相继出现黏液便、脓血便，伴有反应迟钝，不喜活动，倦怠懒动、毛发凌乱、拱背、饮食饮水减少、体质量减轻，甚至死亡现象。到实验结束时，仍排稀烂便。3个用药组：在用药1周后大鼠黏液血便逐渐减少，活动逐渐增多，饮食饮水量逐渐增加，其中以肠涤清＋肠炎清组大鼠症状改善最为显著，实验结束时，部分大鼠已排颗粒状大便。
　　
　　实验结束时，模型组有5只大鼠死亡，肠涤清组有1只死亡，肠涤清＋肠炎清组有3只死亡，SASP组有2只死亡。其中肠涤清＋肠炎清组有2只大鼠是在灌胃过程中窒息而死，立即打开腹腔观察，发现肠外壁与周围组织无明显黏连，纵行剪开肠管，局部肠壁略厚，可见散在糜烂、浅溃疡，周围黏膜略充血、水肿，已无较大较深溃疡；由于所配制的肠炎清1号药液较黏稠，在灌胃过程中误入气管，引起窒息而死亡，考虑死亡原因与UC本身无关。其余大鼠均死于“巨结肠”或腹泻导致的严重营养不良。

    造模后第3天从43只大鼠中随机抽取2只解剖，肉眼观察到结肠黏膜表面充血水肿、糜烂、点状或片状出血、溃疡形成。光镜下可见大量急性炎症细胞浸润，溃疡达黏膜肌层，证明大鼠UC模型造模成功，可以进行本实验研究。

　　3.2  结肠黏膜损伤及病理形态学的变化

　　3.2.1  肉眼观察结肠黏膜损伤情况肉眼观察结肠黏膜损伤大体情况：正常组大鼠结肠黏膜皱襞纹理清晰，未见炎症、糜烂及溃疡；模型组大鼠病变结肠外壁与周围组织黏连，肠壁明显增厚，黏膜明显充血水肿，可见糜烂及溃疡；其他3组大鼠肠壁黏连情况减轻，肠壁增厚较轻，黏膜轻度充血水肿，糜烂、溃疡减轻，肠涤清+肠炎清组充血水肿最轻，已无溃疡，具体各组大鼠CMDI比较详见表2。

　　3.2.2  光学显微镜观察结肠黏膜病理形态正常组：大鼠结肠四层结构清晰，黏膜上皮完整、连续，腺体排列规则、分泌功能活跃，未见炎细胞浸润及血管反应。见图1。

    模型对照组：结肠黏膜可见不同程度的灶性糜烂及溃疡，有的溃疡深达肌层甚至穿孔(可见溃疡底部有渗出物、大量坏死组织、肉芽组织及少量瘢痕组织)。黏膜层变薄，黏膜腺体有不同程度破坏，黏膜及黏膜下见大量炎性细胞(淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞) 浸润，黏膜下层局部充血、水肿。见图1。
   
　　3个用药组：溃疡较浅表或无溃疡，溃疡旁上皮修复明显，腺体增生活跃，隐窝、肠腺及间质可见较多淋巴细胞为主的慢性炎性细胞浸润。见图1。表2  各组大鼠CMDI比较(略)

　　3.3  血清和结肠组织中SOD活力结果各组大鼠血清和结肠组织中SOD活力检测结果见表3。表3  各组大鼠血清和结肠组织中SOD活力检测结果比较（略）

　　采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。与正常组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01，③P<0.05，④P>0.05；与肠涤清组比较，⑤P<0.01，⑥P<0.05，⑦P>0.05；与SASP组比较，⑧P<0.01

　　3.4  血清和结肠组织中MDA含量结果各组大鼠血清和结肠组织中MDA含量检测结果，见表4。表4  各组大鼠血清和结肠组织中MDA含量检测结果比较（略）

    采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。与正常组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01，③P<0.05、④P>0.05；与肠涤清组比较，⑤P<0.05，⑥P>0.05；与SASP组比较，⑦P<0.05

　　3.5  CMDI与SOD、MDA的相关性分析CMDI与SOD、MDA的相关性经Spearman秩相关检验，发现CMDI与血清和结肠组织匀浆SOD活力呈负相关(P＜0.01)，SOD活力越高，黏膜损伤越轻；CMDI与血清和结肠组织匀浆MDA含量呈正相关(P＜0.01)，MDA含量越高，黏膜损伤越严重。见表5。表5  CMDI与SOD、MDA的相关性分析（略）

　　4  讨论

    TNBS和乙醇联合造模时，在乙醇灼伤结肠黏膜后，TNBS与组织蛋白的赖氨酸ε-氨基团结合，成为抗原，使T淋巴细胞致敏，与半抗原结合的动物自身细胞被破坏，从而导致肠道炎症的发生。炎症主要位于黏膜层，亦可累计黏膜下层，较少深达肌层。本实验中，分别运用肠涤清灌肠液灌肠、肠涤清灌肠液灌肠＋肠炎清1号灌胃、SASP灌肠＋灌胃法来治疗活动期实验性UC大鼠。治疗2周后，结果表明3种治疗方法皆可减轻CMDI，尤其以肠涤清＋肠炎清组疗效最为明显（与其他3组比较，P值皆<0.01），在观察结肠黏膜病理形态学方面，运用药物干预治疗后，结肠黏膜炎症都有不同程度的减轻，溃疡变浅变小，炎症细胞减少，证明运用中药综合治疗UC疗效确实。

    至今为止，UC的病因及发病机制尚未完全明了。已有研究证实氧自由基与UC的结肠组织损伤密切相关，SOD活力下降，导致其清除氧自由基的能力下降，对细胞的保护减弱，同时MDA含量升高，脂质过氧化程度加强，进一步加剧对细胞的损伤程度，这是导致结肠炎症及溃疡形成的一个机制，因此本实验选择UC大鼠血清及结肠组织匀浆中SOD活力、MDA含量来评价药物治疗作用。研究发现，造模后模型组UC大鼠血清及结肠组织匀浆中，SOD活力明显下降（与正常组比较，P<0.01），MDA含量明显升高（与正常组比较，P<0.01），与相关报道的实验结果相一致［3，4］。通过药物干预治疗后，3个用药组中大鼠血清和结肠组织中SOD活力皆有不同程度的升高；MDA含量均有不同程度的下降，以肠涤清＋肠炎清组SOD升高和MDA下降最为显著（与其他3组比较，P<0.05或P<0.01）。经过相关性分析发现，血清及结肠组织中SOD活力与CMDI呈负相关（P<0.01），MDA含量与CMDI呈正相关（P<0.01）。

    本研究结果提示，UC的发生发展与SOD和MDA异常有关，血清和结肠组织匀浆SOD活力及MDA含量的变化能反映结肠炎症的严重程度。肠涤清＋肠炎清组可显著提高大鼠SOD活力、降低MDA含量，减轻结肠黏膜炎症，显示岀中药辨证论治、多途径、多靶点作用的优势。提高SOD活力及降低MDA含量是清热祛湿法治疗大肠湿热型UC的可能作用机制之一，其原理可能是清热祛湿中药能有效地清除氧自由基，从而抑制结肠组织中的脂质过氧化反应，并能稳定细胞膜，提高机体抗自由基损伤的能力，从而增强对细胞的保护作用，促进炎症和溃疡的愈合，可为临床治疗提供参考依据。由于本实验条件所限，并未复制出大肠湿热证模型，故动物实验并不能完全说明临床问题，在今后的研究中有待进一步探讨。

【参考文献】
  　　［1］张涛，谢建群.大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究［J］. 中国中西医结合消化杂志，2006，14(4)：240.

　　［2］Vilaseca J，Salas A，Guarner F，et al. Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis ［J］. Gut，1990，31(5)：539.

　　［3］马春曦，李志晋，詹丽英，等.溃疡性结肠炎大鼠肠组织中MDA、SOD、损伤指数的动态变化及其相关性研究［J］.江西医学院学报，2005，45(3)：4.

　　［4］杨辉.热瘀散对溃疡性结肠炎胃肠湿热型大鼠模型MDA、SOD、IL-6的影响［J］.广西中医药，2007，30(4)：54.