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作者：兴桂华 张晓杰 张春庆 胡南 李澎涛
【摘要】 目的 观察通络救脑口服液对β淀粉样蛋白1～40（Aβ1～40）诱导的老年性痴呆（AD）模型大鼠海马CA3区超微结构及C反应蛋白（CRP）表达的影响。方法 140只SD大鼠随机分为空白对照组、假手术组、阴性对照组、阳性对照组及3个实验组（12、24、48 mg·kg-1·d-1剂量组），共7组。采用大脑海马立体定向注射凝聚态Aβ1～40诱导AD动物模型，药物干预4 w后，透射电镜观海马组织超微结构的变化，免疫组织化学染色和计算机图像分析技术测定海马区CRP阳性目标积分光密度。结果 电镜观察结果显示：模型组大鼠海马变性，通络救脑口服液能改善大鼠海马神经元病理改变。与假手术组比较，模型组大鼠海马区CRP蛋白表达增高（P＜0.05）；与模型组比较，通络救脑口服液低、中、高各剂量组CRP蛋白表达均显著降低（P＜0.05）。结论 通络救脑口服液对AD模型大鼠脑内海马组织超微病理改变具有改善作用，并且能明显降低大脑海马组织CRP蛋白的表达，具有抗炎作用。
【关键词】 炎症；老年性痴呆；通络救脑口服液；免疫组织化学染色；电镜
研究认为，β淀粉样蛋白(Aβ)斑块的形成伴随中枢神经炎性损害是老年性痴呆（AD）的主要病理特点。炎症既是引起AD退行性病变和痴呆的必要因素，又可以导致AD的神经退行性病变〔1〕。C反应蛋白（CRP）属于一群独特的血清蛋白家族，具有免疫识别和免疫调节功能，能够激活补体、促进吞噬等调理作用，已被公认是一种敏感的非特异性的炎症标志物〔2〕。海马CA3区锥体细胞在信息储存和提取中起重要作用，与学习记忆密切相关〔3〕。为此本实验采用大脑海马立体定向注射β淀粉样蛋白1～40(Aβ1～40)建立AD大鼠模型，并用通络救脑口服液进行药物干预，观察通络救脑口服液对AD模型大鼠海马CA3区超微结构改变及CRP蛋白表达的影响，探讨通络救脑口服液对AD的可能防治作用途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物
通络救脑口服液主要成分为栀子苷和三七总皂苷，本品含原药有效成分7.7 mg/ml，由北京中医药大学中药学院制备。盐酸多奈哌齐片由法国PFIZER PGM公司提供，产品批号5136903。
1.1.2 动物与分组
140只SD雄性大鼠，鼠龄8～12 w，体重(280±10) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK（京）20020003，适应性饲养1 w，随机分为7组：空白对照组、假手术组、阴性对照组（模型组）、阳性对照组（盐酸多奈哌齐组）和3个剂量实验组（通络救脑口服液），每组20只。
1.1.3 仪器及试剂
PURELAB PLUS 超纯水系统（美国波尔公司）；WELL wash 4MK2洗板机（芬兰Labsystems公司）；EM208S透射电子显微镜（荷兰飞利浦）。Aβ1～40由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。使用前用无菌生理盐水稀释成10 μg/μl，37℃孵育1 w，使其变为聚集状态的Aβ。兔抗CRP由天津津脉基因测绘有限公司提供。链霉亲合素生物素过氧化物酶复合物（SABC）即用型试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
实验大鼠1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，立体定位仪固定头部，备皮消毒，沿颅顶中线作2 cm切口，分离骨膜暴露头骨，于前囟向后3.0 mm，中线左右各旁开2.2 mm，用牙科钻打开颅骨，垂直进微量进样器针2.8 mm，将1 μl溶液缓慢注入，注射时间为5 min，留针5 min，阴性、阳性对照组、各剂量实验组左右侧海马各注射1 μl Aβ1～40(10 μg)溶液，假手术对照组注射1 μl生理盐水。造模后3 d开始给药，盐酸多奈哌齐组0.33 mg·kg-1·d-1，通络救脑口服液组12、24、48 mg·kg-1·d-1，1次/d灌胃给药，其余3组给等体积生理盐水，共4 w。
1.3 检测指标
药物干预完成后进行取材，切取海马CA3区组织约1 mm3体积块，置入2.5%戊二醛中固定，常规电镜包埋、超薄切片，透射电镜观察并拍摄照片。采用SABC法：石蜡切片，常规脱蜡至水。3% H2O2孵育25 min，微波抗原修复。滴加封闭用正常山羊血清工作液室温孵育并倾去。滴加1∶300稀释的兔抗CRP，4℃冰箱过夜。滴加生物素化二抗工作液37℃孵育20 min。滴加SABC复合物37℃孵育20 min。显色，复染，脱水，封片。Motic Med 6.0数码医学图像分析系统计算积分光密度。
1.4 统计学分析
应用SPSS13.0进行统计学处理。正态性检验用KolmogorovSmirnov法，方差齐性检验用Levene法。参数检验用单因素方差分析，组间两两比较运用SNK检验。
2 结 果
2.1 海马CA3区超微结构观察结果
空白对照组：神经元核膜结构清晰，染色质呈细沙状分布，胞质内粗面内质网丰富，可见次级溶酶体吞噬脂滴。神经毡区突触膜结构完好，小泡数量较少，偶见脂褐素颗粒。假手术组：神经毡区突触膜融合状态，突触小泡数量代偿性增多。阴性对照组：粗面内质网脱颗粒，部分细胞核膜增厚，单位膜结构不清，神经毡区有灶性纤维溶解区、锥体细胞明显减少。阳性对照组：细胞双层核膜清晰、核仁明显，细胞器丰富，粗面内质呈脱颗粒状态，线粒体发达，游离核蛋白体非常丰富，偶见脂褐素。中低剂量组：神经元细胞核仍呈锯齿状，核膜表面局灶性增厚，脂褐素数量减少，尼氏体增多，游离核蛋白体发达。高剂量组：神经细胞核仁明显，双层核膜结构清晰，细胞功能活跃。细胞胞质内含有丰富的游离核蛋白体和高尔基复合体，少量脂褐素颗粒。见图1。 2.2 通络救脑口服液对AD模型大鼠海马区CRP蛋白表达的影响
与空白对照组(2.93±0.49)和假手术组比较(3.10±0.39)，阴性对照组CRP蛋白表达增高(8.95±0.57)(P＜0.05)；与阴性对照组比较，通络救脑口服液低、中、高剂量组CRP蛋白表达（分别为6.36±0.53，5.57±0.34，4.76±0.31）显著降低（P＜0.05）；与阳性对照组比较(6.82±0.55)，中、高剂量组CRP蛋白表达显著降低(P＜0.05)。图1 各组海马CA3区超微结构
3 讨 论
海马是AD中最易受累的脑区之一，因而AD有“海马痴呆”之称。海马与学习记忆特别是近期记忆功能密切相关，尤其是CA3区锥体细胞同时接受齿状回颗粒细胞及直接穿通通路的神经元投射，在信息储存和提取中起重要作用，并且神经纤维的出芽、轴突的生长在大鼠进行空间辨别性学习记忆活动时，需要在CA3区多形层内建立某种新的信息，以适应新的功能需要，证实CA3区与学习记忆的关系密切〔4〕。本实验观察CA3区超微结构变化，结果发现，注射Aβ1～40后，阴性对照组出现海马神经元凋亡现象，而通络救脑口服液能恢复神经细胞的损伤，使锥体细胞和突触增加，提示在动物体内，通络救脑口服液具有良好的抗神经细胞凋亡，改善学习记忆的作用。
AD患者脑内老年斑周围发现有急性期蛋白、细胞因子及其他炎症反应相关蛋白，其可能来自老年斑中的活化小胶质细胞和星形细胞，可产生的补体成分、细胞毒C5b9，说明有炎症机制参与AD发病〔5〕。体外培养的结果也充分表明，老年斑的主要成分β淀粉样肽可通过激活胶质细胞，使其产生并释放炎性细胞因子，从而引起毒性反应，细胞因子促进Aβ在AD脑内神经炎性斑中沉积，在AD发病中起重要作用〔6〕。脑衰老和炎症皆可引起Aβ沉积，进而使急性损伤转化为慢性炎症，并诱发释放炎症介质及细胞因子，促使神经细胞产生神经纤维缠结并导致神经细胞死亡或加速凋亡〔7〕。因此，推测AD可能是中枢神经系统内免疫活性细胞过度激活而导致的免疫炎症反应。
CRP是由细胞因子诱导肝脏合成的一种急性期反应蛋白，已被公认是一种敏感的非特异性的炎症标志物，CRP通过体液和细胞免疫而清除靶细胞，CRP和相关的分子血清淀粉蛋白P成分结合到核抗原，损伤细胞膜，并且使细胞发生凋亡。临床实验表明〔8〕，AD患者血清CRP水平显著升高，提示炎症可能是其中枢神经功能受损的原因之一。本实验阴性对照组大鼠海马区CRP蛋白表达较假手术组显著增高，表明脑内注射Aβ1～40可诱导炎症相关蛋白CPR表达增高。而通络救脑口服液组则CRP表达较阴性对照组减弱，表明通络救脑口服液具有抑制CRP表达增高的功能，起到发挥抗炎作用。已有研究〔9〕证实，抗炎药物有延缓和推迟AD发生的作用。并且前期研究工作表明〔10〕，通络救脑口服液可降低血清肿瘤坏死因子（TNFα）和白细胞介素（IL1β）的含量。综上所述，通络救脑口服液可能通过降低CRP的表达，降低细胞因子的含量，进而减轻脑组织炎症反应，从而发挥其抗AD的作用。
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9 Zonderman AB.Predicting Alzheimer′s disease in the baltimore longitudinal study of aging〔J〕.J Geriatr Psychiatry Neurol，2005；18(4):1925.
10 张晓杰，牛英才，周 丽，等.通络救脑口服液对实验性类AD大鼠血清细胞因子含量的影响〔J〕.时珍国医国药，2007；18（6）：13267. |
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