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作者：王振显 蔡文清 庞国勋 宋永周 陈康宁 孙福振 杨涛
【摘要】 目的 探讨人脱细胞羊膜（Human acellular amniotic membrane ，HAAM）负载大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)进行膀胱替代修复的可能性。方法 用去污剂洗涤和酶消化方法制备HAAM。将大鼠MSCs在体外培养、扩增、传代。取第4代干细胞用1%二甲亚砜（DMSO）预诱导8 h，然后应用膀胱匀浆上清液诱导7 d。将诱导分化后的MSCs接种于HAAM表面进行短暂体外培养，获得组织工程膀胱。将雄性大鼠60只随机分为3组，行半膀胱切除术，然后分别采用负载干细胞后的HAAM（A组）、HAAM（B组）以及单纯缝合（C组）的方法进行修补，每组20只。分别于术后2、4、8 w测定膀胱容量、进行膀胱造影并取材观察组织再生情况。结果 去污剂洗涤联合酶消化法能有效去除人羊膜中的细胞成分，光镜及电镜观察无细胞成分残留，细胞相容性好。大鼠膀胱重建术后，A、B两组与C组膀胱最大容量(Volmax)比较有极显著性差异（P＜0.01），而A、B两组之间膀胱最大容量比较无显著性差异（P＞0.05）。组织学观察，2 w时HAAM即已吸收降解，膀胱移行细胞和平滑肌细胞开始形成，A组吻合修补区较厚，平滑肌细胞规则且丰富。结论 HAAM作为膀胱移植物进行膀胱修补吸收降解迅速，负载MSCs后构建的组织工程膀胱是理想的替代修补材料。
【关键词】 膀胱；移植；脱细胞羊膜；生物医学工程
最早应用组织工程学原理进行组织工程膀胱构建的是Wake forest大学医学院再生医学研究所的Atala等人，他们于1998年进行了同种异体狗再造膀胱的实验研究〔1〕。目前组织工程学技术的研究主要集中在二个方面：①支架材料的研究与开发；②种子细胞的培养和植入受损的组织，使其功能得到恢复。膀胱无细胞基质和小肠黏膜下层是目前报道最多的组织工程膀胱支架材料。羊膜是一种天然高分子生物材料，来源广泛，不违背伦理。本研究采用化学去污剂和酶消化的方法去除新鲜羊膜中的细胞成分，保留细胞外基质，制备人脱细胞羊膜（HAAM）作为支架材料，并以大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)为种子细胞构建了组织工程膀胱，探讨异种来源的HAAM作为生物支架材料构建组织工程膀胱的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
4～6周龄100～150 g健康清洁级SD大鼠2只，8周龄220～250 g大鼠4只，雌雄不限。8周龄以上成年健壮雄性300～500 g大鼠60只，由河北医科大学实验动物中心提供。LDMEM及0.25%胰蛋白酶（Sigma公司），胎牛血清（北京元亨圣马公司）、,PBS液，二甲基亚砜（DMSO，美国R&D公司），1% TritonX100,小鼠抗大鼠α平滑肌肌动蛋白一抗，山羊抗小鼠二抗。日本Olympus荧光倒置显微镜IX71和光学显微镜CX31。SHZ88台式水浴恒温震荡器（江苏太仓市实验设备厂）。
1.2 种子细胞培养
1.2.1 SD大鼠MSCs的分离与原代培养〔2〕
4～6周龄大鼠2只，无菌取其双侧股骨、胫骨和胸骨，用LDMEM培养基冲出骨髓于离心管中，吹打制成单细胞悬液，离心后用生长培养基重悬。将细胞接种于培养瓶中，37℃、5% CO2环境下常规培养。
1.2.2 大鼠膀胱匀浆上清液对MSCs的诱导分化
8周龄大鼠4只，无菌取其膀胱，立即用PBS液冲洗，匀浆、离心，取上清液用0.2 μm的针头滤器过滤。取第4代MSCs以2×104/ml密度接种于预置盖玻片的6孔培养板中培养2 d，使细胞贴壁。吸出培养基，换入含有1% DMSO的培养基预诱导8 h，然后换入膀胱匀浆上清液与DMEM为1∶1的混合培养基培养7 d。期间换液1次。
1.2.3 培养细胞免疫细胞化学染色鉴定及纯度计算
诱导分化的MSCs以α平滑肌肌动蛋白（SMαactin）抗体行免疫细胞染色，以未进行诱导的MSCs为阴性对照，进行同样的染色处理。光学显微镜下观察，随机选择10个镜野，计算纯度,纯度＝染色细胞数/细胞总数，取平均值。
1.3 HAAM制备
1.3.1 羊膜的选材
严格遵循供体医学标准。在获取健康胎盘后，PBS液反复冲洗，钝性分离羊膜与绒毛膜组织，去除羊膜基底面残存的绒毛膜和血管组织，浸泡于以0.01 mol/L PBS液稀释的1% TritonX100中，反复震荡摇晃24 h，然后置入1%胰蛋白酶中再震荡摇晃4 h取出，PBS冲洗。制备好的单层羊膜为白色半透明的薄膜，有一定弹性及韧性，厚约0.1 mm。由于其较薄，缺乏一定的张力，尚不能用于手术修补。将6～8片处理好的单层羊膜按彼此纤维方向垂直的位置重叠，以200 W的可见光照射3 h，从而使其交联成0.6～0.8 mm的较厚补片，张力大大增加，能耐受缝合牵拉的力量。以钴60射线照射20 min消毒（20 kGy）后备用。
1.3.2 HAAM细胞毒性测定
按照文献〔3〕要求制备HAAM浸提液；取诱导分化的MSCs按1×104细胞/孔接种于96孔板，正常培养基组为对照组，浸提液组为实验组；MTT法测定吸光度A值，计算细胞相对增殖率（RGR）,RGR＝实验组A值/对照组A值，并对材料毒性评分〔4〕。
1.4 组织工程膀胱的构建
1.4.1 MSCs接种
诱导分化后的MSCs以2×104/ml密度接种于预置2 cm×2 cm HAAM的6孔培养板中后加培养基2 ml。置37℃、5%CO2培养箱内，在饱和湿度条件下复合培养。
1.4.2 MSCs/HAAM复合物显微镜检查
收获培养36 h的MSCs/HAAM复合物，HE染色光镜及扫描电镜检查。 1.5 大鼠膀胱修复重建实验
1.5.1 大鼠膀胱重建
将60只兔随机分为3组，每组20只。麻醉后取下腹部正中切口，显露膀胱，游离膀胱周围组织，行半膀胱切除术，以婴幼儿输液器作为导尿管顺行置入，尿道外口处4号丝线妥善缝合固定尿管。A组以MSCs/HAAM复合物补片用50可吸收线缝合于膀胱缺损处，B组以单纯HAAM补片修补膀胱，C组不使用任何材料直接缝合。经尿管注水检查无漏尿。A、B两组以10丝线在吻合口前、后、左、右（浆膜面，避免穿透）各缝1针作为标记。C组吻合口上下端以10丝线缝合2针作为标记。尿管于术后7 d拔出。所有动物术后均肌肉注射青霉素抗感染3 d。
1.5.2 术后膀胱检测
分别于术后2、4、8 w时，每组取5只动物处死。处死前测定膀胱最大容积(Volmax)。方法是将膀胱排空，用注射器经细尿管（婴幼儿输液器）向膀胱注入生理盐水，尿道外口有尿液滴出时注入的水量即为Volmax。解剖观察膀胱大体形态，并根据标记线取材固定，HE染色后光镜下观察组织学变化。第8周时各组动物进行膀胱造影后再进行前述处理。
1.6 统计学方法
数据采用x±s表示,组间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 种子细胞培养
原代培养的骨髓细胞成分复杂,形状不规则。7～9 d细胞长满瓶底，主要呈纺锤形细胞。诱导分化7 d后MSCs转变为梭形平滑肌样的细胞，融合后形成峰谷排列，部分细胞表现为SMαactin染色阳性，胞浆呈现棕黄色。随机计数10个视野计算诱导分化率为（45.6±3.5）%。未进行诱导的MSCs亦有少量细胞SMαactin染色阳性（3.8±0.77）%。
2.2 HAAM检测
将经物理和酶处理的HAAM做HE染色，置光学显微镜下观察，可见大量浅红色胶原纤维未受损，无蓝染核物质，表面没有残留的细胞碎屑。扫描电镜下HAAM表面粗糙，一面为网状纤维结构，孔隙较多，大小不一。两面均无细胞残留(图1)。HAAM浸提液组细胞平均相对增殖率为88%，毒性评分为Ⅰ级（表1），证明所制备的HAAM组织相容性好，符合生物材料应用要求。表1 细胞相对增殖率和细胞毒性分级(略)
2.3 组织工程膀胱构建
复合培养36 h后HE染色观察可见HAAM材料上生长的细胞，部分融入支架材料内；扫描电镜下可见MSCs生长良好，且有突起伸出固定于周围支架材料（图1）。
2.4 大鼠重建膀胱的大体观察及容量测定
A、B、C三组术后1 w内分别死亡5只、4只和1只，均死于尿外渗和膀胱周围感染。另外A、B两组均有一只动物有明显尿外渗（腹腔肿大），但未死亡，后尿外渗逐渐好转。术后2 w时重建膀胱被大网膜包绕，仔细分离后可见标记线内膀胱已愈合良好，但较薄，不能辨认出HAAM。4、8 w时仍可见局部黏连，A、B两组膀胱已达正常膀胱外观，C组膀胱明显缩小，局部黏连比A、B两组轻微。2 w时A组大鼠膀胱的Volmax为(1.21±0.60) ml，B组为(1.12±0.53) ml，两组比较无统计学意义（P＞0.05），C组(0.75±0.41) ml,与A、B两组比较均有显著差别(P＜0.05)。随时间延长，4、8 w时大鼠的膀胱容量略有增加但两组仍无差别。8 w时膀胱造影见A、B两组重建的膀胱与正常膀胱相似，C组膀胱明显缩小（表2、图2）。
2.5 重建膀胱的组织学观察
A组和B组术后2 w时HAAM修复区已有上皮细胞和膀胱平滑肌细胞形成，但B组平滑肌和上皮层较薄，平滑肌不规则，A组则上皮层和平滑肌略厚，相对规则。两组均有嗜酸细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润（图3）；4和8 w时两组已经与正常膀胱组织无明显区别。C组2 w时切口区仅轻微炎性细胞浸润，无其他异常。表2 手术各组术后不同时间Volmax的测定结果（略）
3 讨 论
组织工程学是近年来新兴起的一门学科，受到了科学界的广泛关注。其核心是利用组织工程学技术与生命科学的成果，将活细胞与生物材料结合，修复、重建、维持、恢复或提高人体组织的功能〔5〕。组织工程的理想支架材料应该具备如下条件：①有良好的组织相容性；②生物可降解性；③无免疫原性；④具有多孔性和高空隙率，利于细胞的贴附和生长，诱导组织再生；⑤可塑性；⑥有一定机械强度。而HAAM作为一种天然细胞外基质生物材料，几乎具备以上各种生物特性，最有可能在组织体内完全再生，并可负载细胞生长。Meller〔6〕将结膜细胞种植于羊膜上，BrdU标记后植入无胸腺鼠皮下，植入后14 d可以追踪到84%的标记细胞，同时其他指标也显示黏附于羊膜上的细胞具有干细胞特点，表明羊膜为干细胞提供了有利环境。本实验应用去污剂洗涤和酶消化的方法获得HAAM，经过光镜和电镜检查，完全去除了细胞碎屑，降低了细胞免疫原性，又不损害HAAM的胶原成分，采用MTT法进行了细胞相对增殖性测定，细胞相对增殖率＞80%，细胞毒性Ⅰ级，符合生物材料的应用要求，因此是理想的支架材料。
稳定可靠迅速地获取充足的有活力的细胞源是组织工程的另一个重要问题。目前膀胱组织工程中常用的种子细胞为膀胱移行上皮细胞和膀胱平滑肌细胞，进行支架材料双面种植〔7〕。但是上皮细胞和膀胱平滑肌细胞取材培养困难，且体外扩增传代有限，双面种植较为困难。MSCs是来源于中胚层的一类干细胞，主要存在于骨髓及其他结缔组织，不仅具有向中胚层分化的能力，而且具有向内胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力，在特定条件下可定向分化为骨、肌肉、血管内皮和神经等多种终末功能的细胞，参与自身组织细胞的更新、再生、修复和分化〔2〕。杨景全等报道〔8〕，大鼠脊髓匀浆上清液可在体外有效地诱导骨髓MSCs分化为神经样细胞。受此启发，我们利用膀胱组织匀浆上清液和DMSO对MSCs 在体外进行诱导分化为平滑肌样细胞，经α平滑肌肌动蛋白抗体检测，诱导分化率将近50%，因此可作为种子细胞进行种植。各种资料及临床经验提示，移行上皮具有很强的再生及修复能力，因此本实验未专门进行上皮细胞的种植。实际上，在体内微环境的影响下，部分MSCs亦有自主向上皮细胞转化的可能。
MSCs与HAAM在体外短暂培养24～36 h即可完成体外组织工程膀胱的构建，扫描电镜检查可见细胞黏附固定在支架材料上。重建膀胱的组织学显示，2 w时HAAM移植物即已降解吸收，移行上皮和膀胱平滑肌开始形成。无论单独使用HAAM还是使用MSCs/HAAM复合物进行膀胱替代，均没有发生移植排斥和坏死反应。比文献报道的应用无细胞膀胱基质（厚约0.3 cm）进行膀胱替代吸收要早，炎性反应要轻微。表明HAAM组织相容性好，降解吸收快速完全且排斥反应轻微。虽然A、B两组在膀胱容量上没有显著性差别，但组织学显示应用MSCs/HAAM复合物修补的膀胱修补区肌肉组织再生比较完全，其膀胱动力学功能可能要优于单独应用HAAM进行修补的膀胱。这需要进一步的实验来证实。无论如何，与单纯缝合而不用任何生物材料的C组相比，A、B两组膀胱容量明显较大，证实HAAM移植比单纯缝合膀胱更能维持其生理功能。
本实验表明，负载了以MSCs作为种子细胞HAAM是较理想的组织工程膀胱材料，具有良好的应用前景。
【参考文献】
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3 中国标准出版社第一编辑室编.医疗器械生物学评价标准汇编,医疗器械生物学评价第12部分.样品制备与参照样品〔M〕.北京：中国标准出版社，2004:808.
4 中国标准出版社第一编辑室编.医疗器械生物学评价标准汇编,医疗器械生物学评价第5部分.体外细胞毒性实验〔M〕.北京：中国标准出版社，2004:18697.
5 Langer R，Vacanti JP.Tissue engineering〔J〕.Science，1993;260 (5110)：9206.
6 Meller D，Dabul V，Tseng SC.Expansion of conjunctival epithelial progenitor cells on amniotic membrane〔J〕.Exp Eye Res，2002;74(4):53745.
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8 杨景全，路来今，闫 俊，等.大鼠脊髓匀浆上清液对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用〔J〕.中国老年学杂志,2007；27（2）：2456. |
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