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作者：庄莹 石博 田歆 崔丽
【摘要】 目的 探讨人参皂苷Rg2对Aβ2535诱导的阿尔茨海默病（AD）大鼠模型的学习记忆能力及老年斑（SP）形成的影响。方法 大鼠腹腔注射人参皂苷Rg2预防给药，大鼠双侧海马内注射Aβ2535建立AD模型，采用Morris水迷宫和被动回避性跳台反射实验检测各组大鼠的学习记忆能力；Bielschowsky 银染色改良法检测各组大鼠SP的表达。结果 模型组和溶媒组大鼠学习记忆能力较正常对照组明显下降，人参皂苷Rg2各剂量预防给药组大鼠的学习记忆能力较模型组有所增强；模型组、溶媒组和低剂量组大鼠大脑皮质中有SP形成，呈均匀致密的嗜银团，其余各组均未观察到SP。结论 人参皂苷Rg2对AD大鼠的学习记忆能力有一定的保护作用，并能防止SP的形成。
【关键词】 人参皂苷；阿尔茨海默病；大鼠
文献报道人参皂苷Rg1能够有效改善阿尔茨海默病（AD）模型的学习记忆能力〔1〕。人参皂苷Rg2与Rg1同属于人参皂苷三醇型，分子结构相似。本实验的目的在于观察人参皂苷Rg2对AD模型大鼠学习记忆能力和老年斑（SP）形成的影响。
1 材料与方法
1.1 动物分组
3～5月龄清洁级Wistar大鼠84只，体重（250±10）g，购于吉林大学白求恩医学院实验动物中心（SCXK吉20030001），随机分为正常对照组、AD模型组、银杏达莫组、溶媒组、人参皂苷Rg2低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组12只，雌雄各半。自然条件下饲养，正常饮食。
1.2 主要试剂及仪器
Aβ2535，sigma公司；人参皂苷Rg2采用1，2丙二醇为溶媒，由吉林大学药学院李平亚教授惠赠；银杏达莫注射液，贵州益佰制药；大鼠脑立体定位仪，日本NARISHIGE公司产品；Morris水迷宫，成都泰盟机械设备厂制造；大鼠被动回避性跳台反射实验系统，中国医学科学院药物研究所产品；AX70 OLYMPUS光学显微镜，日本制造。
1.3 方法
1.3.1 预防给药
各组均采用腹腔注射方式进行预防给药。正常对照组和AD模型组给予生理盐水2 ml·kg-1·d-1；银杏达莫组给予银杏达莫注射液，3.6 mg·kg-1·d-1；溶媒组给予1，2丙二醇，1 ml·kg-1·d-1，人参皂苷Rg2低、中、高剂量组给予人参皂苷Rg2 3、6、12 mg·kg-1·d-1，连续给药4 w。
1.3.2 建立AD模型
预防给药第15天时，采用海马内注射Aβ2535方法建立AD模型。Aβ2535用生理盐水稀释成浓度为2 μg/μl的溶液，37℃孵育1 w，形成聚合状态的Aβ2535。各实验组大鼠经6%水合氯醛（30 mg/kg）麻醉后，备皮，固定于大鼠脑立体定位仪上，常规消毒皮肤，沿颅顶中线剪开皮肤，暴露头骨及前囟。参照文献〔2〕，选定注射位点为前囟后3.5 mm，中线旁2.0 mm处。用牙科钻钻开颅骨，微量加样器吸取Aβ2535溶液4 μl，垂直进针，达蛛网膜下3.0 mm处，缓慢注射，5 min内完成，留针5 min后取出。采用相同方法进行对侧海马内等剂量药物注射。AD模型组、银杏达莫组、溶媒组及人参皂苷Rg2各剂量组大鼠海马内均注射Aβ2535，正常对照组大鼠海马内注射等体积生理盐水。清洁创面后缝合皮下组织和皮肤，对合好切口，强力碘消毒，待大鼠清醒后放回笼中常规饲养。
1.3.3 Morris水迷宫实验
各实验组建立AD模型2 w后进行Morris水迷宫实验，其间继续腹腔给药。Morris水迷宫系统的圆形水池直径120 cm，高60 cm，水池中水面高约28 cm；圆柱形有机玻璃平台直径14 cm,高25 cm，位于水面下2～3 cm处。室温及水温均保持在（22±2）℃；测试时以鲜牛奶加水搅浑至看不到平台为止。大鼠于测试前将头颈部用苦味酸涂黄。圆形水池分成四个象限，平台放置于第1象限的中心位置，大鼠沿1至4象限的顺序在每个象限的固定入水点处放入水池。水面上方1.5 m处的摄像机连接于路径追踪系统，可追踪大鼠头颈部黄色标记，并拍摄记录其在水中的游走轨迹。通过计算机软件分析逃避潜伏期即大鼠从入水至找到并爬上平台所需的时间。Morris水迷宫实验连续7天。第1天至第6天，进行定位航行实验，按1、2、3、4象限的顺序在入水点处将大鼠头朝池壁轻轻放入水中，记录120 s内的逃避潜伏期，取其平均值作为学习能力指标。第7天为空间搜索实验，撤掉平台，仅在一固定象限将大鼠放入水中，记录120 s内大鼠穿过原平台位置的次数，作为记忆能力的指标。
1.3.4 被动回避性跳台反射实验
水迷宫实验结束后进行。第1天将大鼠放入跳台仪的反应箱中,适应环境3 min后通以36 V交流电,大鼠受到电击后，多数跳上绝缘平台逃避电击。大鼠可能再次或多次跳至铜栅上后又跳回绝缘平台，如此训练5 min，记录大鼠的跳台次数，又称错误次数，以此作为学习能力的指标。在此基础上，24 h后重新测试,先将大鼠放在绝缘平台上，在铜栅上通电并开始计时，记录大鼠第一次跳下平台所用的时间作为潜伏期，以 5min内跳下的次数作为错误次数，将上述两项作为大鼠记忆能力的指标。 1.3.5 Bielschowsky银染色改良法
跳台实验结束后，将大鼠快速断头处死，冰上取脑。福尔马林浸泡固定，切取海马注射点前后约3 mm厚脑组织，经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后，经冠状面切片，片厚3 μm。切片脱蜡至水，放入预先加热至37℃的20%硝酸银溶液内30 min，蒸馏水速洗，入10%中性甲醛液还原20 s，Marsland氏银氨溶液中作用30 s，取出切片去除多余的银溶液，再入10%中性甲醛液还原1 min，蒸馏水冲洗，入5%硫代硫酸钠水溶液中作用约5 min，常规脱水、透明，中性树胶封片，AX70 OLYMPUS光学显微镜观察，银染色处呈黑色，背景呈黄色。
1.4 统计学分析
行为学结果数据以x±s表示，两组间差异用SPSS10.0统计学软件进行t检验分析。
2 结 果
2.1 Morris水迷宫实验
定位航行试验：各组大鼠在前3天的学习中，逃避潜伏期并无明显差异。第4天至第6天，与正常对照组相比AD模型组大鼠逃避潜伏期明显延长(P＜0.01）。与AD模型组相比，溶媒组无显著性差异；银杏达莫组、人参皂苷Rg2各剂量组逃避潜伏期均明显缩短(P＜0.01或P＜0.05)。人参皂苷Rg2各剂量组与银杏达莫组相比，第4天时，人参皂苷Rg2低剂量组大鼠的逃避潜伏期显著延长(P＜0.01），其余均无明显差异。空间搜索试验：与正常对照组大鼠相比，AD模型组大鼠穿台次数明显减少(P＜0.01)。与AD模型组相比，溶媒组大鼠穿台次数无显著差异；银杏达莫组、人参皂苷Rg2中、高剂量组大鼠穿台次数均明显多于AD模型组(P＜0.05)；人参皂苷Rg2低剂量组大鼠穿台次数虽高于AD模型组，但无统计学意义。人参皂苷Rg2各剂量组大鼠穿台次数均低于银杏达莫注射液组，尤其是人参皂苷Rg2低剂量组更为明显(P＜0.05），见表1。表1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果(略)
2.2 被动回避性跳台反射实验
与正常对照组相比，AD模型组大鼠第1天、第2天错误次数明显增多，潜伏期明显缩短（P＜0.01）。与AD模型组大鼠相比，溶媒组的错误次数和潜伏期均无明显变化；银杏达莫组、人参皂苷Rg2中、高剂量组的潜伏期延长和错误次数减少,均有显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）；低剂量组的潜伏期较模型组明显延长（P＜0.01），错误次数虽有下降趋势，但无统计学意义。人参皂苷Rg2各剂量组与银杏达莫组相比，低剂量组大鼠潜伏期显著低于银杏达莫组（P＜0.05），但错误次数无明显变化;中、高剂量组大鼠的错误次数与潜伏期均无明显变化。见表2。表2 各组大鼠被动回避性跳台反射实验结果(略)
2.3 Bielschowsky 银染色改良法
正常对照组、银杏达莫组、人参皂苷Rg2中、高剂量组大鼠大脑皮质及海马内均未见SP形成；AD模型组、溶媒组、人参皂苷Rg2低剂量组大鼠大脑皮质内可见SP，呈均匀致密的嗜银团（图1）。
3 讨 论
人参皂苷三醇型中的Rg1是目前研究发现的人参皂苷中对AD治疗作用较为显著的一种。人参皂苷Rg2与Rg1同属三醇型，但其对AD的防治作用目前少见报道。本实验中Morris水迷宫实验结果证实AD模型组与溶媒组大鼠的学习、记忆能力低下，说明AD模型建立成功。人参皂苷Rg2低剂量组大鼠学习能力有一定的提高，而人参皂苷Rg2中、高剂量组大鼠的学习记忆能力则有显著性的提高。被动回避性跳台反射实验结果则显示人参皂苷Rg2各剂量组大鼠的学习能力均有明显改善，尤以高剂量组最为明显；人参皂苷Rg2中、高剂量组大鼠记忆能力有所提高。两项行为学检测指标的结果基本相同，表明人参皂苷Rg2对AD模型大鼠的学习记忆能力具有一定的改善作用，并且随着给药剂量的加大，效果更为明显。
SP是AD的主要病理特征，而Aβ是SP的主要成分。Aβ是由淀粉样前体蛋白（APP）裂解产生的。APP是人体各种组织中广泛存在的一种跨膜蛋白，在正常情况下，它只裂解产生极少量的Aβ〔3〕。但是，在一些遗传和非遗传因素的影响下，APP代谢异常，可产生过多的Aβ在大脑皮质和海马中沉积，形成SP。SP在AD的发病过程中起着非常重要的作用。Aβ沉积具有细胞毒性作用，能诱导神经元凋亡。Bcl2是重要的神经元凋亡抑制基因 〔4〕，而Bax能促使神经元凋亡，它们构成了一对平衡体系。Paradis等〔5〕研究发现，Aβ能使Bcl2表达减弱，Bax表达增强，从而诱导神经元凋亡。Aβ能够激活脑组织中的小胶质细胞和星形胶质细胞，使这两种细胞围绕在SP的周围〔6〕。活化的小胶质细胞能产生大量炎性因子，如IL1，IL6，并产生补体成分，如C1r,C1q等，诱发脑内炎症反应和自身免疫反应，损伤神经元〔7〕。另外，Aβ还能导致突触功能异常，是认知障碍的重要原因〔8〕。有研究发现〔9〕，人参皂苷Rg2能使Bcl2、HSP70的表达增多，Bax、P53的表达减少，说明人参皂苷Rg2具有调整凋亡蛋白表达的能力，从而抑制Aβ沉积诱导的神经元凋亡， 因而能保护学习记忆能力，从而起到预防AD的作用。
已有实验证实〔10〕，银杏叶提取物能有效提高AD大鼠的学习记忆能力，并明显减少SP沉积。因此，本实验采用银杏达莫注射液作为阳性对照药物。实验结果显示，与AD模型组相比，银杏达莫组和人参皂苷Rg2各剂量组大鼠的学习记忆能力均有所增强，除人参皂苷Rg2低剂量组外，大脑皮质及海马内均未见SP，说明人参皂苷Rg2能一定程度的抑制SP的形成，可能对AD模型大鼠的学习记忆能力起到了一定的保护作用。但其具体的作用机制仍需进一步深入探讨和研究。
【参考文献】
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10 吴树亮，金连弘，李呼伦，等.银杏叶对阿尔茨海默病（AD）治疗作用的实验研究〔J〕.解剖科学进展，2004；10（4）：28991. |
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