PEP1SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性


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PEP1SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性

PEP1SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性

作者：张友恩，王家宁，唐俊明，郭凌郧，杨建业，黄永章，郑飞，孔霞

【摘要】 目的：研究PEP1SOD1融合蛋白转导进入大鼠心肌组织的能力，并测定转导的目的蛋白酶活性. 方法：实验分为SOD1组和PEP1SOD1组，分别经大鼠尾静脉注射500 μg纯化后的SOD1及500 μg纯化后的PEP1SOD1融合蛋白入大鼠体内，于注射后 0.5，1，2，4，8，24 h时间点取心脏（n=6，每组，每个时间点），经40 g/L多聚甲醛溶液固定 6 h后行冰冻切片，通过免疫组织化学方法检测PEP1SOD1进入大鼠心肌组织的能力和分布情况. 黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织SOD1 活性. 结果： PEP1SOD1组注射后0.5 h时，大鼠心肌组织中即出现均一的明亮红色荧光信号，分布于细胞浆及细胞核，具有时间依赖性的特点，荧光强度最强点为1 h 时间点，而SOD1组未见到红色荧光信号. 于注射后0.5 h时SOD1活性开始升高PEP1SOD1组为（85.37±1.67），SOD1 组为（52.23±0.67），两组相比较，差异具有统计学意义（P<0.01）；注射后1 h时SOD1 活性可达高峰，PEP1SOD1组为（119.16±1.37），SOD1 组为（53.47±1.02），两组相比较，差异具有统计学意义（P<0.01），2～24 h逐步下降；SOD1组各时间点间相比较差异无统计学意义（P>0.05）. 结论： PEP1SOD1融合蛋白能以天然活性形式迅速高效的转导入大鼠心肌组织，并保持酶活性达24 h.

【关键词】 细胞穿透肽；PEP1肽；超氧化物歧化酶

0引言

研究发现，只有高度脂溶性、分子质量不超过600道尔顿的化合物或6个氨基酸残基以下的小肽才能直接透过细胞膜或血脑屏障，这为无特异受体/通道和入胞方式的具有治疗作用的大分子物质有效地发挥功效造成了极大的障碍. PEP1是Morris等［1］设计的一种新的细胞穿透肽（cell penetrating peptide, CPP），PEP1能够把β半乳糖苷酶（βgalactosidae，βGal），抗体、增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP），人Cu，ZnSOD等大分子物质以天然活性形式转导入细胞内而不需预变性［2-3］. 铜，锌超氧化物歧化酶（Cu，Znsuperoxide dismutase；SOD1）是细胞中高水平表达的SOD形式，可以专一性清除超氧阴离子（O2-），从而防止氧应激损伤［4］. 由于SOD1系大分子物质，在生物体内无特异受体和通道，也不能依靠内吞作用等人胞方式进入细胞内，生物学作用的发挥受到很大的限制. 本研究通过基因工程手段表达和纯化SOD1和PEP1SOD1融合蛋白，研究PEP1SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性，为临床应用抗氧化酶SOD1治疗氧应激损伤提供依据.

1材料和方法

1.1材料健康雄性SD大鼠72只，体质量(250±20) g，(湖北省实验动物中心)；pBluescript Ⅱ SKSOD1质粒（美国西奈山医学院生物化学/药理学系白景香博士惠赠）；pGEMT easy vector 系统（美国Promega公司）；pET15b，E.coli BL21（DE3）（美国Novagen公司）；DH5α（郧阳医学院临床医学研究所提供）；PEP1肽DNA序列（北京赛百盛基因技术有限公司）；异丙基硫化βD半乳糖苷（isopropyβDthiogalactoside, IPTG）（美国Promega公司）；兔抗Hisprobe（G18）抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；小鼠抗心肌TnT抗体，四乙基若丹明异硫氰酸盐（tetraethyl rhodamine isothiocyanate, TRITC）标记的山羊抗兔二抗、异硫氰酸荧光素（fluoresein isothiocyana

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