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靶向Livin的siRNA提高MDAMB231细胞对阿霉素敏感性的可能机制 |
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靶向Livin的siRNA提高MDAMB231细胞对阿霉素敏感性的可能机制 |
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作者:李凡 王小毅 田甜 陈力 李佳 任国胜
【摘要】 目的: 采用RNA干扰技术下调Livin基因的表达,观察其提高乳腺癌细胞对阿霉素化疗的敏感性及机制. 方法: 构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体,转染乳腺癌细胞MDAMB231后,通过实时定量PCR,Western Blot技术检测干扰前后Livin和Caspase3的表达;采用MTT法检测细胞增殖的变化以及细胞对阿霉素的半数抑制浓度(IC50),流式细胞法检测细胞周期,TUNEL法检测其诱导细胞对阿霉素化疗增敏作用,并观察细胞超微结构变化. 结果: 成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体,siLivin2对Livin的mRNA和蛋白抑制效率最高,分别为76.4%和70.2%,同时Caspase3的mRNA和蛋白表达升高约157.1%和38.6%(P<0.05). siLivin2转染48 h后,与未转染组相比,细胞增殖活力受到抑制,siLivin2联合阿霉素使细胞周期阻滞于G0/G1期(P<0.05),显著提高了细胞对阿霉素敏感性,其凋亡率达到(38.35±2.64)%,IC50降低为(2.46±0.87) mg/L,差异具有统计学意义(P<0.05). 透射电镜下可见细胞胞质浓缩,染色质聚集为小团块,电子密度增高. 结论: 靶向Livin siRNA真核表达载体可以有效地下调MDAMB231细胞Livin基因的表达,并且通过上调Caspase3的表达抑制细胞增殖,显著增强其对阿霉素的敏感性.
【关键词】 乳腺肿瘤;Livin基因;RNA干扰;阿霉素
0引言
Livin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的新成员,它在肿瘤组织中特异性表达并具有强大的抗凋亡作用,已成为肿瘤基因治疗新的靶点[1]. 近年的研究[2]认为,凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式,IAP家族在调节肿瘤细胞对凋亡敏感性方面起着核心作用. 而特异性阻断肿瘤细胞内高表达的Livin基因,可以抑制细胞增殖并增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[3],但其化疗增敏作用的发生机制尚不明确. 我们通过构建靶向Livin的siRNA真核表达载体,转染乳腺癌细胞MDAMB231,观察Livin表达下调对细胞阿霉素化疗敏感性的影响,并探讨其发生的可能机制.
1材料和方法
1.1材料人乳腺癌细胞株MDAMB231(中科院上海细胞资源中心);shRNA质粒载体pGeneSil1(武汉晶赛公司);LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司);质粒提取试剂盒(美国Omega公司);总RNA提取试剂、实时定量PCR扩增试剂(大连TaKaRa公司);兔抗人多克隆抗体Livin(美国Imgenex公司);兔抗人多克隆抗体Caspase3,辣根过氧化物酶标记羊抗兔多克隆抗体(北京中杉生物技术有限公司);TUNEL检测试剂盒(德国Roche公司).
1.2方法
1.2.1靶向Livin的siRNA真核表达载体的构建利用Ambion公司在线设计程序,针对GenBank中Livin(No.NM022161,No.NM139317)的共同序列,筛选出三条干扰序列,即siRNA1:5′CTGGCCTCCTTCTATGACT3′;siRNA2:5′GGAAGAGACTTTGTCCACA3′;siRNA3:5′CCGTGTCCATCGTCTTTGT3′;同时设计非特异性靶序列:5′GACTTCATAAGGCGCATGC3′. 将化学合成的正义链和反义链退火,与经HindⅢ和BamHⅠ酶切后线性化的pGeneSil1载体连接,经筛选,酶切鉴定后测序. 所得质粒命名为siLivin1, siLivin2, siLivin3和 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页 |
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