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作者：沈楠，王艳春，任旷，顾饶胜，范红艳
【关键词】 原花青素类;心肌；成纤维细胞;一氧化氮;一氧化氮合酶
0引言原花青素(procyanidin，PC)是越桔重要的生物活性成分，是表儿茶素和表没食子儿茶素的低聚体或多聚体. 有研究［1-3］发现，PC具有抗氧化、抗肿瘤、抗衰老及抗炎症等作用，但对越桔PC药理活性的相关研究还少见报道. 本研究以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导心肌成纤维细胞(CFb)增殖，观察越桔PC对CFb诱导型一氧化氮合酶 一氧化氮(iN0SNO)系统的影响，以探讨PC抑制CFb增殖的初步机制.
1材料和方法
1.1材料Wistar大鼠30只，1～3日龄（吉林大学基础医学院实验动物中心）；越桔原花青素（南京苏朗医药科技开发有限公司）; AngⅡ和MTT（美国Sigma公司）；IMDM，血清（GIBCO公司）；iNOS一抗（Santa cruz公司）;胰蛋白酶（宝泰克生物科技公司）;羟脯氨酸试剂盒，iNOS试剂盒（南京建成生物工程公司）;TGFβ1 ELISA试剂盒（晶美生物工程有限公司）；NO试剂盒（碧云天生物技术研究所）；SP试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）；FITC羊抗兔Ig（北京中杉金桥生物技术有限公司）.
1.2方法
1.2.1细胞分离与培养Wistar大鼠无菌开胸取心肌, DHanks液清洗,剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片，20 mL/L胰蛋白酶反复消化(37℃水浴,8 min/次),分别收集各次消化上清液，1000 r/min,离心5 min，弃上清,用含10 mL/L血清的IMDM培养基重悬沉淀制成细胞悬液,接种培养瓶中,置37℃，50 mL/L CO2培养箱内培养. 用差速贴壁法去除内皮细胞及心肌细胞. 实验采用第3～5代细胞.
1.2.2实验分组与处理CFb细胞分为： 对照组，模型组，PC药物治疗组. 各组细胞无血清培育24 h后，除对照组外均给予终浓度为1×10-7mol/L的AngⅡ，药物治疗组同时给予PC，终浓度分别为25，50，100 mg/L，对照组给予10 mL/L血清的IMDM培养基.
1.2.3MTT法检测将CFb以1×108/L个细胞密度接种于96孔板,每孔200 μL. 分别给予不同的处理因素作用48 h. 每孔加入MTT溶液（5 g/L） 20 μL，37℃继续培养4 h，终止培养，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min后，酶标仪490 nm波长处，测吸光度(A)值，以（各实验组A值/对照组A值）×100%表示细胞增殖率.
1.2.4TGFβ1蛋白及胶原含量测定各因素处理后，分别在培养的24和48 h吸取细胞上清液，按照试剂盒操作说明测定TGFβ1蛋白含量及胶原含量.
1.2.5NO含量、iNOS活性测定各处理因素与CFb共孵育6 h. 检测细胞上清夜中NO含量及iNOS活性的变化. 实验操作按NO,iNOS试剂盒说明书进行.
1.2.6免疫荧光细胞化学染色将CFb加入到预先放置盖玻片的24孔板，各因素作用6 h. 将生长有CFb的盖玻片取出，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min,山羊血清室温封闭30 min；滴加一抗（兔抗大鼠,1∶50稀释）4℃过夜;PBS洗3次;再滴加FITC标记的二抗(羊抗兔),37℃ 1 h, PBS洗15 min×3次;观察并拍照. 用ImagePro Plus图像分析软件（Media Cybernetics公司）检测平均吸光度值.
统计学处理：实验数据以x±s表示，组间比较采用方差分析及q检验进行. P<0.05为差异具有统计学意义. &nb [1] [2] [3] 下一页 |
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