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作者：杜标炎，张爱娟，谭宇蕙，易华，吴映雅，郭玉荣
【摘要】 【目的】观测六味地黄丸含药血清对自杀基因HSVtk/GCV系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的增效作用，探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性。【方法】构建HSVtk/GCV自杀基因治疗系统，并确定丙氧鸟苷（GCV）的工作浓度（392μmol/L）;制备SD大鼠4d和8d六味地黄丸（剂量为32g·kg-1·d-1）灌胃含药血清和生理盐水灌胃空白血清；用大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk-或tk+与tk-1∶9比例混合细胞按3×103个/孔铺96孔板，分为空白血清组、GCV加空白血清组、10%tk+/GCV加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组及10%tk+/GCV联合含药血清组；含药血清又再分为低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组6个复孔，用完全培养基培养24h后，各组分别加入相应空白血清或含药血清，孵育12h，加入终浓度392μmol/L的GCV，培养60h，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞活性，Q值法分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性。【结果】空白血清组、含药血清组、GCV加空白血清组、GCV加含药血清组细胞均未显示明显的细胞毒性。10%tk+/GCV加空白血清组及10%tk+/GCV联合不同浓度的含药血清组均具有显著杀伤作用（与空白血清组比较，Ｐ＜００５），联合组存活率显著低于10%tk+/GCV加空白血清组（Ｐ＜００５）；含药血清中剂量和高剂量组的联合作用具有协同性（Q＞11５），且有浓度依赖性。给药4d血清和给药8d血清结果无显著性差异（P＞005）。【结论】六味地黄丸含药血清对自杀基因系统10%tk+/GCV杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞具有协同增效作用，且有一定的量效关系。
【关键词】 六味地黄丸/药理学；肝肿瘤/中西医结合疗法；基因治疗；肿瘤细胞，培养
自杀基因疗法由于存在旁杀伤效应的独特机制已成为恶性肿瘤基因治疗的研究热点和最有应用前景的肿瘤基因治疗方法，目前已在临床病人及实验动物中广泛用于恶性肿瘤试验性治疗，并已观察到较好的效果［1-4］。但体内自杀基因治疗仍存在载体转染效率低、靶向性不够、治疗载体的毒副作用等问题，严重制约了其临床应用。进一步提高疗效和减少毒副作用是研究热点之一，联合治疗则能在一定程度上达到上述目的［5］。中医药是一个伟大宝库，许多中药方药具有肯定的药理效应［6-8］，联合中医药也可能是一种可行的方案。我们已有的初步研究结果表明［9-10］，自杀基因治疗联合补肾方药六味地黄丸在体内和体外均能起到协同增效的作用。本研究拟在细胞水平上对其量效关系作进一步地论证，现将结果报道如下。
1材料和方法
11主要试剂与仪器RPMI1640为Gibco公司产品；新生牛血清为TBD公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）、丙氧鸟苷（Ganciclovir,GCV）、二甲基亚砜（DMSO）均为美国Sigma公司产品；细胞培养瓶、培养板、冻存管、滤膜等均为美国Corning公司或丹麦MUNC公司产品；BNA3210型CO2培养箱（日本ESPEC）；5WCJ1F超净工作台（苏州净化设备厂）；3K18型高速冷冻离心机（德国Sigma）;3169型倒置显微镜（重庆COIC）；ALG1104型电子天平（日本岛津）；CDBER SCAN 510型pH仪（意大利HANNA）；NEX POWER 1000型纯水器（韩国Human Corp）等。
12细胞株病毒包装细胞PT67购自美国Clontech公司，已于前期将重组pLXSNtk质粒转染入PT67细胞内构建了重组病毒包装细胞，记为PT67tk［11］。大鼠肝癌CBRH7919细胞购自中山大学动物中心细胞库。前期已用PT67/tk的含病毒上清培养液感染大鼠肝癌CBRH7919细胞，筛选获得稳定整合、表达tk基因的重组大鼠肝癌CBRH7919/tk+细胞［12］。
13实验动物SD大鼠，体质量180~230g，雄性，健康，清洁级［动物合格证号SCXK（粤）2003~0001，粤监证 [1] [2] [3] [4] 下一页 |
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