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轻微复染后常规脱水封片。以上染色各步均需用pH74磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次×5min。选择肝癌组织作为阳性对照，阴性对照选择PBS液代替一抗。
144Western blot方法检测p38MAPK及磷酸化p38MAPK蛋白活性加细胞裂解液（20mmol/LTrisHCl、150mmol/LNaCl、1mmol/LNa2EDTA、1mmol/L EGTA、10mg/LTriton、25mmol/L焦磷酸钠、1mmol/Lβ磷酸甘油、1mmol/LNa3VO4、1μg/mL Ieupeption）于分离提取的Kupffer细胞中，冰上裂解30min，用细胞刮刮下，将其吸取置于EP管中，4℃、13000r/min离心30min×2次，均取上清液，置于-80℃冰箱中保存。以紫外分光光度计测定蛋白浓度，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）法，每孔加样蛋白浓度为20μg。电泳结束后取出凝胶，将其转移至硝酸纤维素（PVDF）膜上，以50g/L脱脂奶粉封闭；与一抗（p38MAPK兔多克隆抗体，稀释比1：1000，稀释液为50g/L脱脂奶粉）室温孵育2h；加二抗（Antirabbit IgG,HRPlinked;HRPconjugated antibiotin antibody,稀释比均为1：1000，稀释液为50g/L脱脂奶粉）室温孵育2h。将膜放入Lumiglo和Peroxide配制的显色液中，室温1min。取出膜，于暗室中与X光片一起曝光并显影、定影。最后用DolphinSCAN扫描，Dolphin ID软件分析结果，以相对于正常组的D值代表蛋白的相对表达量。同样的方法检测p38MAPK蛋白磷酸化水平，一抗为磷酸化p38MAPK兔单克隆抗体。 15判断标准
151脂肪性肝炎炎症活动度计分［8-9］具体计分标准见表1。表1炎症活动度计分标准（略）
152肝脏组织病理学变化肝细胞脂肪变性程度判断标准见表2。表2肝细胞脂肪变性程度判断标准（略）
153NFκBp65表达按阳性细胞所占百分比，并结合染色强度作适当调整进行半定量分析。即：高倍镜下取10个不同视野，每个视野计数100个细胞，取其平均值。结合本次实验情况，根据阳性细胞的百分比与染色强度，参照许良中等［10］制订的判断标准，先将染色强度打分，0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再将阳性细胞所占的百分比打分：0分为阴性，1分为阳性细胞＜5%,2分为阳性细胞占5%~25%，3分为阳性细胞占25%~50%，4分为阳性细胞＞50%。染色强度与阳性细胞百分分值的乘积0分为阴性，＞3分为表达阳性，＞6分为强阳性。由此根据阴性、阳性进行χ2检验，再将NFκBp65表达强度与病理分级进行等级相关分析。
16统计学方法
采用SPSS1
10软件包进行数据分析，计量资料组间比较用方差分析，等级资料用秩和检验，NFκBp65阳性率比较用χ2检验及Fishers确切概率检验；肝组织脂肪变性程度与NFκBp65阳性表达的相关性用χ2检验相关分析。
2结果
21各组光镜观察结果
正常组大鼠肝脏肝小叶结构清晰，细胞索排列整齐，肝血窦正常，肝细胞无明显病变，核结构清晰。模型组大鼠肝细胞增大，胞浆内脂滴大小不一，呈中至重度肝细胞脂肪变性，细胞水肿严重。模型组与正常组比较脂肪变程度差异有显著性意义（P＜005）。综合组、祛湿组、活血组大鼠肝组织脂肪变程度较模型组有不同程度减轻，但差异无显著性意义（P＞005）。结果见表3、图1（彩图见第199页）。
表3各组大鼠肝细胞脂肪变程度比较（略）
模型组大鼠小叶内炎症较明显，炎症细胞主要以单个核细胞为主，点状或小灶性，部分大鼠可见数个炎症坏死灶融合成片，汇管区亦可见到以单个核细胞为主的炎症细胞浸润，但程度较小叶内轻，未出现碎屑样坏死和桥接坏死。正常组、疏肝组和健脾组炎症活动计分显著低于模型组（P＜005）；其他各用药组炎症计分情况与模型组比较差异无显著性意义（P＞005）。提示模型组大鼠脂肪性肝炎明显，疏肝和健脾方药对脂肪性肝炎的炎症活动有明显的抑制作用。结果见表4、表5。表4炎症活动度分级表（略）表5各组炎症计分表（略）
22免疫组化结果正常组大鼠肝组织NFκB p65表达最弱，阳性表达率最低（111%）。模型组肝组织NFκBp65表达最强，阳性表达率最高 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] 下一页 |
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