作者：李文兵，胡昌江，李兴华，黄勤挽，谢锋，谢秀琼 

【摘要】  　　目的建立益智仁盐炙前后高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，探讨盐炙对益智仁内在成分的影响。方法对益智仁生品、盐炙品饮片进行HPLC/UV指纹图谱分析，色谱柱采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈和水梯度洗脱，检测波长为260 nm，柱温：35℃，流速：1.0 ml/min。结果益智仁盐炙后有两个新的色谱峰出现,7个特征峰相对含量发生变化。结论益智仁通过盐炙后化学成分既有量的变化，也有质的变化。

【关键词】  益智仁　盐炙　高效液相色谱法　 指纹图谱
　
　　Abstract：ObjectiveTo establish HPLC fingerprints of Fructus Alpiniae Oxyphyllae between the raw and the salt processing, and to investigate the impact on the internal components of Fructus Alpiniae Oxyphyllae after salt processing.MethodsAnalyze the HPLC/UV fingerprints of Fructus Alpiniae Oxyphyllae between the raw and the salt processed on the chromatographic column of Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) eluted by acetonitrile and hydraulic gradient. The detection wavelength was 260 nm, the column temperature was 35℃, and the flow rate was 1.0 ml/min .ResultsTwo new chromatographic peaks existed and the contents of seven characteristic peaks changed after salt processing of Fructus Alpiniae Oxyphyllae. ConclusionThe change of chemical composition in Fructus Alpiniae Oxyphyllae's  between the raw and the salt processing can be found not only in quantity but also in quality.

　　Key words：Fructus Alpinia oxyphyllae;  Salt processed;  HPLC;  Fingerprints

    益智仁为姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的干燥成熟果实，本草文献始见于唐·陈藏器《本草拾遗》。生品辛温而燥，主要归脾经，以温脾止泻、收摄涎唾力胜；盐炙后可缓和辛燥之性，以温肾固精缩尿为主，如《修事指南》指出：“益智仁盐炒，止小便频数”。益智仁经盐炙后药性和功效均发生了改变，揭示盐炙后其内在成分有可能发生了改变。本实验采用梯度洗脱法建立益智仁高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析方法，以圆柚酮作为参照物，对益智仁生、炙品进行对比研究，为深入阐明益智仁盐炙前后药性和功效的改变提供一定的依据。

　　1  器材

    Varian ProStar高效液相色谱仪（含ProStar 210二元泵，ProStar 325紫外/可见光检测器，Prostar 500柱温箱，Workstation 6.3色谱工作站）； BP211D电子天平（感量0.01 mg，德国Sartorius公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

    圆柚酮对照品由美国Sigma公司提供(批号：10112423，纯度>98%)，乙腈（色谱纯，美国Fisher公司），水（重蒸水），为色谱流动相；甲醇为分析纯。益智仁药材产地为海南琼中，经本校生药教研室卢先明教授鉴定确认为姜科植物益智Alpinia oxyphylla Miq.的干燥成熟果实,盐炙益智仁按筛选出的最佳工艺条件制得［1］。

　　2  方法与结果

　　2.1  参照溶液的制备精密称取圆柚酮对照品适量，用甲醇稀释制成每毫升含圆柚酮0.02 mg对照品溶液。

　　2.2  供试品溶液的制备取生、盐益智仁粉末（过40目筛）约1 g，精密称定,加甲醇20 ml索氏提取2 h，提取液转移置25 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

　　2.3  益智仁HPLC指纹图谱的建立

　　2.3.1  色谱条件及系统适用性试验色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A：水，B：乙腈，流动相比例见表1；检测波长：260 nm；记录时间：85 min；柱温：35℃；流速：1.0 ml/min。表1  流动相比例（略）

　　2.3.2  样品测定取供试品溶液各20 μl 注入液相色谱仪, 按“2.3.1”项下色谱条件测定, 记录色谱图。在供试品色谱中, 以圆柚酮色谱峰的保留时间和色谱峰面积为1, 计算各指纹峰的相对保留时间和相对共有峰面积值。

　　2.4  方法学考察

　　2.4.1  仪器精密度实验取生益智仁粉末，精密称定,按“2.2”项下制备供试液，连续进样6次，考察仪器的精密度。结果表明,各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化, RSD分别为0.08%～0.99%和0.36%～1.43%，表明仪器精密度良好。

　　2.4.2  稳定性实验取生益智仁粉末，精密称定,按“2.2”项下制备供试液，分别在0，2，4，8，12和24 h进样，记录色谱图。结果表明,各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化,RSD分别为0.10%～1.02%和0.24%～1.25%，表明样品24 h内稳定性良好。

　　2.4.3  重复性实验取生益智仁粉末5份，精密称定,按“2.2”项下制备供试液，记录指纹图谱。结果表明,各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积比值无明显变化,RSD分别为0.06%～1.23%和1.02%～1.54%，表明重复性良好。

　　2.5  生益智仁指纹图谱共有模式的建立取10批生益智仁粉末，按“2.2”项下方法制成供试品溶液,分别取20 μl进样,记录指纹图谱,其相似度分别为0.975，0.968，1，0.984，0.990，0.979，0.981，0.982，0.990，0.978。生品共有模式见图1。

　　2.6  盐炙益智仁指纹图谱共有模式的建立取10批盐炙益智仁粉末，按“2.2”项下方法制成供试品溶液,分别取20 μl进样,记录指纹图谱,其相似度分别为0.980，0.971，1，0.991，0.989，0.968，0.965，0.979，0.982，0.984，盐炙品共有模式见图2。

　　2.7  益智仁盐炙前后指纹图谱比较分别取益智仁生、炙品，按“2.2”项下方法制成供试品溶液,分别取20 μl进样,记录指纹图谱(图3),其中13号峰为益智仁主要指标成分圆柚酮,将其定为内参比峰,计算各色谱峰与内参比峰的保留时间及峰面积比值,得各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积值。见表1。表1  益智仁（生、炙品）指纹图谱相对保留时间和相对峰面积（略）

　　3  讨论

　　3.1  检测波长的选择实验考察了220，235，254，260，275 nm 5个波长，综合考虑已知益智仁中有效成分圆柚酮和其他成分的吸收,表明以260 nm处检测的图谱信息量最多,峰形较好,溶剂干扰少,基线平稳。

　　3.2  流动相的选择分别对甲醇-水和乙腈-水系统进行5%～100%范围的梯度洗脱比较,结果表明,在乙腈-水在表1流动相条件下所得色谱峰分离度、峰形较好。

　　3.3  参照物的选择圆柚酮(Nootkatone)又称诺卡酮，属于雅槛蓝(eremophilane)系的双环倍半萜酮，在抗实验性胃溃疡、抑制脂多糖活化巨噬细胞中NO的产生和抑制由抗原引发的RBL-2H3细胞的脱落等方面具有显著的活性，为益智药材的有效成分之一［2］。我们前期工作表明圆柚酮为盐炙益智仁缩尿有效部位（石油醚部）的主要成分之一，且盐炙前后圆柚酮含量无明显变化，故本实验选用圆柚酮作为参照物。

    益智仁经盐炙后HPLC指纹图谱上出现了2个新色谱峰（2，4号峰），与圆柚酮（13号峰）相比有7个峰相对含量发生了变化，而盐炙后这些成分质与量的变化与缩尿作用有无相关，有待进一步研究。

【参考文献】
  　　［1］李兴迎， 胡昌江， 林 辉，等. 中药益智仁盐炙工艺的正交实验法研究［J］.时珍国医国药,2008,19(7):1574.

　　［2］Morikawa T，Matsuda H， Toguchida I，et al.Absolute stereostructures of three new sesquiterpenes from the fruit of Alpinia oxyphylla with inhibitory effects on nitric oxide production and degranulation in RBL-2H3 cells［J］.J Nat Prod，2002，65(10)：1468.