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作者：曹昭 卫红飞 张培因 张永胜 徐海飞 胡小平 万敏 于永利 王丽颖 王华
【摘要】 目的 构建一种能预防Asia Ⅰ型口蹄疫病毒（FMDV）的感染表位重组蛋白疫苗，并对其免疫学活性进行研究。方法 以Asia Ⅰ型FMDV VP1上的B细胞表位和T细胞表位氨基酸序列为抗原位点，设计了包含上述位点的、具有最佳空间构象的重组蛋白，命名为“CZ1”。通过PCR及基因克隆等方法构建了其表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过镍亲和层析和G25凝胶过滤层析纯化及复性，获得具有免疫学活性的重组蛋白CZ1。免疫豚鼠获得含针对AsiaⅠ型FMDV中和抗体的血清，通过细胞中和试验及乳鼠中和试验，检测豚鼠血清中抗FMDV的保护性中和抗体滴度。结果 该基因工程重组蛋白能够在动物体内诱导产生抗AsiaⅠ型FDMV具有保护性的中和性抗体。结论 该基因工程重组蛋白有望开发成预防AsiaⅠ型FDMV感染的新型疫苗。
【关键词】 基因工程疫苗；FDMV；重组蛋白；活性检测
口蹄疫（FMD）是由FMD病毒（FMDV）引起的一种人和动物共患的急性发热性高度接触性的传染病〔1〕。传统FMD疫苗为弱毒疫苗或灭活疫苗，虽具有良好的免疫原性，但由于存在着灭活不彻底以及防护不当，而致病毒扩散传播的危险，这些不安全因素促使人们寻求新型的疫苗。有研究证明，T和B细胞抗原原位串联连接构建而成的基因工程疫苗能引起有效的机体免疫应答，有利于具有保护性的中和抗体的产生〔2〕。本研究以Asia Ⅰ型FMDV VP1上的B和T细胞表位氨基酸序列为抗原位点，采用计算机软件筛选出最佳的表位组合形式，拟利用基因工程方法构建、表达包含上述位点的氨基酸序列的重组蛋白，以探索一种新型的AsiaⅠ型FMDV基因工程疫苗。
1 材料与方法
1.1 菌种、质粒、引物、试剂、动物及FMD灭活疫苗
JM109菌种、BL21(DE3)菌种、质粒pMD18T和pET28a(+)均由本室保存。引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、dNTP、T4连接酶均购自TAKARA公司。IPTG购自Promega。其他试剂均为国产分析纯或试剂纯。层析介质NiSepharose 4B、G25 Superdex 购自Healthcare GE。牛AsiaⅠFMD灭活疫苗购自内蒙古生物药品厂。豚鼠购自长春高新技术开发区医学动物实验研究中心。
1.2 重组质粒pET28aCZ1的构建及鉴定
结合文献报道，选取Asia Ⅰ型VP1上的B和T细胞表位的氨基酸序列，结合计算机空间构象模拟筛选出多个T、B细胞表位串联形式的重组蛋白。用PCR法构建表位的基因序列，将其与pMD18T连接后，构建串联的重复序列；采用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，将基因片段亚克隆至经同样双酶切的pET28a（+）质粒上，构建成含目的基因片段的pET28aCZ1重组质粒；送上海生工生物工程技术有限公司进行测序。
1.3 CZ1重组蛋白疫苗的表达
将重组质粒pET28aCZ1转化至E.coli BL21(DE3)表达菌中，经LB平板筛选后，挑取单克隆接种至LB培养液，于37℃、220 r/min振荡培养，当菌液A600=0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，37℃、220 r/min振荡诱导、培养3 h，离心收集细菌。取诱导前后样品进行SDSPAGE鉴定。
1.4 CZ1蛋白的纯化
取10 g湿菌与裂菌液（含8 mol/L尿素）按1∶5(M/V)重悬后，4℃、搅拌4 h。10 000 r/min离心15 min，取上清加载至预先平衡的NiSepharose 4B层析柱中。用含4 mol/L尿素的洗涤液洗涤至A280到基线后，洗涤液中尿素浓度降至3 mol/L，洗涤1 h后，尿素浓度降至1 mol/L洗涤3 h后，洗脱CZ1蛋白；收集目的蛋白后，加载到预先平衡的G25 Superdex层析柱中，收集CZ1蛋白。将每步骤留取的样品进行SDSPAGE鉴定。
1.5 豚鼠免疫
取3只体重为300 g左右豚鼠，股内侧肌肉注射CZ1蛋白质（200 μg/只），同时设立PBS对照和AsiaⅠ型FMDV灭活疫苗阳性对照。免疫后第21天采集血清。
1.6 中和试验
①96孔板细胞培养板中加50 μl/孔的细胞维持液，再加入50 μl/孔倍比稀释的免疫后21 d的豚鼠血清，最后加入50 μl/孔200 TCID50稀释的病毒，CO2培养箱中孵育1 h后，加入BHK21细胞，CO2培养箱中培养72 h后，萘黑蓝染色，Karber法计算血清中和抗体滴度。②取灭活补体的免疫21 d后的豚鼠血清分别按1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀释，病毒用维持液稀释至200 TCID50/100 μl，将病毒稀释液和各稀释度的血清等量混合后，37 ℃水浴1 h，乳鼠背部注射，100 μl/只，每份血清的每个稀释度注射4只二日龄乳鼠，观察并记录注射后68 h每组乳鼠的存活情况，并以Karber法计算保护性中和抗体的滴度。
1.7 统计学处理
应用SPSS11.0软件进行两组间方差检验。
2 结 果
2.1 重组蛋白质空间结构的预测
通过DNA star软件及Expasy网站，对表位的多种构建方式进行蛋白质的二及三级结构预测，筛选出一种能模拟天然构象的表位组合形式，其空间结构预测结果见图1，其RGD序列（如箭头所示）充分暴露在细胞表面，可能有利于中和性抗体的产生。后续实验按照这种表位组合形式构建并表达目的蛋白，并命名为“CZ1”。 2.2 pET28aCZ1重组质粒的构建
通过PCR法合成目的基因经TA连接后，将其亚克隆至原核表达载pET28a，获得重组质粒pET28aCZ1。pET28aCZ1 经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，与预期相符（预期为945 bp），见图2。DNA测序结果与预期相符。
2.3 CZ1蛋白的表达及纯化
将重组质粒pET28aCZ1转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌后，接种至LB培养基中，待细菌生长至A600=0.6时，加入IPTG继续诱导培养3 h。SDSPAGE分析显示，目的蛋白质分子量约为42 kD，与预测结果相符，表达产量约占菌体总蛋白的50%左右。经诱导后的菌体，以8 mol/L 尿素裂解包涵体，上清经镍亲和层析和G25凝胶过滤层析纯化，得到纯度达到90% 的重组蛋白CZ1。见图3。
2.4 FMDV细胞中和试验
观察在牛Asia Ⅰ型FMDV活病毒的攻击下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否中和该病毒对BHK21细胞的感染。若该血清中含有针对牛AsiaⅠ型FDMV的中和抗体，则可中和FMDV对BHK21细胞的感染而使其存活。结果显示，免疫后第21天的3份豚鼠血清中和抗体滴度的几何均数为286，灭活病毒组为320，与PBS组（≤3）比较差异显著(P<0.01)。表明CZ1蛋白可以激活豚鼠体液免疫反应，产生了针对Asia Ⅰ型FMDV的中和抗体。
2.5 中和试验
观察在活的Asia Ⅰ型FMDV的攻击下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否保护乳鼠抵抗该病毒的攻击。将PBS组和CZ1蛋白免疫的各3份豚鼠血清分别按1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀释，分别与FMDV孵育1 h后，注射4只乳鼠。如豚鼠血清中含有针对AsiaⅠ型FMDV的中和抗体，则乳鼠存活。结果显示，CZ1重组蛋白免疫的3份豚鼠血清中，针对Asia I型FMDV的中和抗体滴度分别为1∶90、1∶256和1∶90，几何均数为1∶127，与PBS组比较差异显著(P<0.01)（表1）。表明CZ1蛋白可以激活豚鼠体液免疫反应，产生针对Asia Ⅰ型FMDV的中和抗体，能够保护乳鼠抵抗同型活病毒攻击。表1 CZ1蛋白免疫的豚鼠血清中抗FMDV中和抗体滴定水平(略)
3 讨 论
FMDV共有 A、O、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT 3等7个血清型，血清型之间没有交叉免疫〔3〕；在我国，FMD疫情主要以O型、A型、AsiaⅠ三个血清型为主。2005 年初，我国江苏、山东等省相继暴发了AsiaⅠ型FMD，感染动物以牛为主，波及我国大多数省区〔4〕。基因工程疫苗由于安全有效、价廉、易于大规模生产等，成为新型疫苗研究的热点。
在本研究中，根据蛋白质的一级结构决定三级结构从而决定蛋白质功能的原理，通过计算机模拟空间构象的方法筛选最适的基因序列，这种方法大大节省了时间、节约了成本。在设计时，考虑我国及周边国家AsiaⅠ型 FMDV 流行株VP1 基因的抗原位点，以 FMDV VP1 的B和T细胞表位串联的方式，成功地构建了由6个表位组成的重组蛋白。选用大肠埃希氏菌作为表达系统，并考虑了大肠杆菌密码子的偏爱性，对部分基因序列进行了同义突变，以便提高多表位基因在大肠杆菌中的表达效率〔5，6〕，极大提高了重组蛋白CZ1的表达量，约占菌体总蛋白的50%。虽然pET表达系统所表达的蛋白产物带有6个His标签，易于纯化，但大肠埃希氏菌表达系统表达的蛋白缺少诸如糖基化和磷酸化之类的翻译后修饰作用，常形成包涵体，不利于表达产物的纯化回收，且对获得有生物学活性的表达产物造成极大的困难。重组蛋白CZ1为包涵体表达，本室采用了在NiSepharose层析纯化的同时，通过逐步降低洗涤缓冲液中的尿素浓度，使重组蛋白CZ1复性，实现了重组蛋白质纯化和复性同时进行，极大简化了工艺。
本试验结果表明，该重组蛋白疫苗能够诱导豚鼠产生具有针对Asia Ⅰ型FMDV的保护性中和抗体，可以中和该病毒对BHK21细胞的感染，且能够保护乳鼠抵抗同型活病毒的攻击，原因可能是由于重组蛋白CZ1能形成类似于天然FMDV VP1蛋白的三维构象。以上结果表明，该重组蛋白具有保护牛抵抗Asia Ⅰ型 FMDV 的潜能，有可能开被发成为Asia Ⅰ型FMD基因工程疫苗。
致谢：感谢内蒙古金宇生物公司实验中心协助完成细胞中和试验和乳鼠保护试验。
【参考文献】
1 姚玉红.口蹄疫流行现状及防制措施〔J〕.中国公共卫生，2007;23(6)：7667.
2 冉 波，邵明玉，张培因，等.O型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白疫苗的构建、表达和纯化〔J〕.免疫学杂志，2006;22(3)：2658.
3 Grubman MJ，Baxt B.Footandmouth disease〔J〕.Clin Microbiol Rev，2004；4:46593.
4 Guo H，Liu X，Liu Z,et al.Recent outbreaks of footandmouth disease type Asia 1 in China〔J〕.J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health，2006；53:2933.
5 Sanyal A，Hemadri D，Tosh C,et al.Emergence of a novel subgroup within the widely circulating lineage of footandmouth disease virus serotype Asia 1 in India〔J〕.Res Vet Sci，2004;76:1516.
6 Mohapatra JK，Sanyal A，Hemadri D,et al.A novel genetic lineage differentiating RTPCR as a useful tool in molecular epidemiology of footandmouth disease in India〔J〕.Arch Virol，2006;151:8039. |
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