作者:牛彩琴 徐厚谦 张团笑
【摘要】 目的 观察寿聪胶囊对老年痴呆(AD)模型大鼠的学习记忆、海马区乙酰胆碱转移酶(ChAT)阳性细胞的表达及病理形态学影响,探讨寿聪胶囊的防治机制。方法 选用Wistar 雄性大鼠随机分成五组:对照组、模型组、脑复康组及寿聪胶囊低、高剂量组。用D半乳糖和东莨菪碱制备复合AD大鼠模型,应用中药复方制剂寿聪胶囊进行防治。用跳台法测试大鼠的学习记忆能力、免疫组化法观察海马区ChAT阳性细胞的表达变化、光镜下观察脑组织病理形态学的改变。结果 寿聪胶囊组跳台潜伏时间明显延长、触电错误次数显著减少,海马区ChAT的阳性细胞数目显著增多、且染色大多呈阳性,脑组织病理损害明显减轻;与模型组相比均有显著性差异(P<0.01),与脑复康组相似(P>0.05)。结论 寿聪胶囊能提高AD大鼠学习与记忆能力,减轻脑组织的病理损害,可能与拮抗东莨菪碱所致胆碱能神经系统的功能损害,提高ChAT活性,促进Ach合成有关。
【关键词】 寿聪胶囊;老年性痴呆;东莨菪碱;D半乳糖;乙酰胆碱转移酶
现代医学尚缺乏对于AD有效的防治方法,近年大量临床报道,中药复方制剂对AD的防治有较好的临床效果〔1,2〕。中医认为肾虚精亏、痰瘀互阻是AD的主要发病机制,以“补肾填精、涤痰通络”为治法,配制中药复方制剂寿聪胶囊,经初步临床观察疗效较好,但其作用机制有待进一步研究。本实验选用Wistar大鼠,根据AD患者常见的胆碱能神经系统损害学说〔3〕,用D半乳糖和东莨菪碱制备AD复合模型〔4~6〕。通过行为学、ChAT及病理形态的观测,探讨寿聪胶囊对AD大鼠的防治机制,为临床应用提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
健康Wistar雄性大鼠(兰州大学医学实验中心提供)清洁级,体重(250±50)g,共40只。常规饲养1 w后,随机分为5组:对照组,模型组,脑复康组,寿聪胶囊低、高剂量组,每组8只。
1.2 药物与试剂
寿聪胶囊以何首乌、红参、岷当归、锁阳、三七、丹参、泽泻、石菖蒲等中药组方,按一定的剂量比例配制,生药粉碎研磨,由甘肃中医学院附属医院药剂科生产(批号:030102,0.5g/粒);D半乳糖和东莨菪碱由上海恒信化学试剂有限公司提供(批号分别为:20030926、 613K2102201);脑复康由西安交大瑞鑫药业有限公司提供(乙酰胺吡咯烷酮,批号:20031101);乙酰胆碱转移酶(ChAT)免疫组化测定试剂盒由武汉博士德生物工程公司提供。
1.3 模型制备
在脑复康组和寿聪胶囊灌胃防治的第10天开始造模。除对照组用生理盐水外,其余各组每天颈背部注射D半乳糖0.96%(5 ml·kg-1·d-1)3 w后;改用腹腔注射东莨菪碱0.3 mg/ml(2 mg·kg-1·d-1)2 w。
1.4 给药方法
分组后第二天开始各组每天灌胃,除对照组和模型组用等量的生理盐水外,其余各组用相应的药物进行防治。脑复康组用脑复康290 g/L(2.9 g·kg-1·d-1) 灌胃,寿聪胶囊组分别用低剂量54 g/L (0.54 g·kg-1·d-1)和高剂量162 g/L(1.62 g·kg-1·d-1) 灌胃。共50 d。
1.5 主要实验仪器
跳台仪(由甘肃中医学院实验中心提供)、 AO病理切片机(兰州大学病理实验中心提供)、紫外分光光度计(型号:LIV12002,日本岛京仪器厂);荧光分光广度仪(型号:RF5301PC,日本岛京)、照相显微镜(型号:Bx6032FB3F01,0LYMPUS)等。
1.6 观察指标
1.6.1 行为学检测
行为学测试用跳台法。分组后当天进行跳台训练:将大鼠放置在跳台仪内,适应环境5 min,每只大鼠训练5次,然后通电,大鼠逃到安全台上开始记时,至大鼠从安全台上跳下停止记时,此段时间为潜伏期,大鼠5 min内从安全台上跳下受到电击的次数为错误次数。训练后第二天进行防治前的跳台测试,在实验最后一次给药2 h后进行第二次跳台测试,记录各组大鼠的跳台潜伏时间和受到电击的错误次数。
1.6.2 ChAT免疫反应阳性细胞的检测
最后一次行为学测试后,当天禁食,第二天进行标本采集。依次将各组大鼠迅速处死,在冰台上取出脑组织,沿矢状缝切开,甲醛固定,石蜡包埋。在兰州大学病理实验中心,将每个标本的一半脑组织取海马做ChAT的免疫组化法检测,免疫组化的封片在照相显微镜下观察各组海马的ChAT免疫反应阳性细胞变化。
1.6.3 脑组织病理形态学的观察
每个标本的另一半脑组织作HE染色,镜下观察各组大鼠的病理形态学的变化。
1.7 统计学处理
所有数据用x±s表示,使用SPSS11.0软件进行统计学处理,组间用LSD法或t检验。 2 结 果
2.1 寿聪胶囊对AD大鼠学习记忆的影响
造模前测试各组大鼠的行为学无显著性差异。造模后,与对照组比较,模型组跳台潜伏时间明显缩短,触电错误次数明显增多(P<0.01);与模型组比较,寿聪胶囊低、高剂量组跳台潜伏时间明显延长,错误次数明显减少(P<0.01),其作用与脑复康组无显著性差异(P>0.05)(见表1)。
2.2 寿聪胶囊对AD大鼠脑组织ChAT活性的影响
与对照组(32.02±11.39)相比,模型组(10.52±3.76)海马处ChAT的免疫反应阳性细胞明显减少(P<0.01);少数细胞的胞浆呈微弱黄色颗粒(弱阳性),大多数细胞浆呈蓝色(阴性)。与模型组相比,寿聪胶囊低(23.45±8.61)、高剂量组(25.62±10.43)海马的ChAT的阳性细胞数目显著增多(P<0.01),大多数细胞胞浆呈棕色或黄色颗粒(阳性),少数细胞呈棕黄颗粒(强阳性),极少数细胞呈蓝色(阴性);且寿聪胶囊高剂量组优于脑复康组(21.24±8.53,P<0.05)(见图1)。
2.3 寿聪胶囊对AD大鼠脑组织病理形态学的影响
与对照组相比,模型组的脑组织明显萎缩,脑回加深变宽;镜下海马的神经元数目明显减少,形成稀疏区,细胞大小不等,排列散乱,细胞水肿、变性、坏死或呈空泡;胶质细胞大量增生,出现噬细胞现象、胶质结节等,伴大量的软化灶出现。与模型组相比,寿聪胶囊组的脑组织外观基本正常,脑回略增宽;镜下大脑皮层及海马的神经细胞病理改变明显减轻,细胞形态大多正常,细胞分布较均匀,偶见水肿、空泡样变细胞;胶质细胞增生明显减少,偶见噬细胞现象,软化灶大多溶解吸收,且寿聪胶囊高剂量组优于脑复康组(见图1)。表1 寿聪胶囊对AD大鼠跳台试验的影响(略)
3 讨 论
中医认为,AD发病病机为肾虚精亏、痰瘀互阻。病位在脑,与心肝肾密切相关〔7〕。肾为先天之本,藏精养神;脑为元神之府,灵机记性皆在脑中。当肾精亏虚,脑窍失养,心不藏神,肝失疏泄,故出现学习记忆及精神等方面的障碍。痰瘀阻窍是构成智能障碍及AD的基本病理表现。在AD的发生发展中,肾虚为本,痰瘀互阻为标,标本相互影响,共同致病。寿聪胶囊根据中药理论,并结合临床经验,采用补虚填精,解郁散结为治疗大法拟定的中药复方制剂,全方辩证和辨病相结合,标本兼顾,符合中医AD病机特点的遣方用药。本实验采用颈背部注射D半乳糖治亚急性衰老合并腹腔注射东莨菪碱损伤M型胆碱能受体,制备复合AD模型,该模型较单因素更贴近复杂的病理变化过程。通过跳台测试、脑组织病理形态学及海马中ChAT阳性表达的观测:模型组大鼠的学习记忆能力明显下降;脑组织病理损害明显,细胞肿胀变性增多,胶质细胞大量增生,大量的软化灶生成;ChAT免疫反应阳性细胞明显减少,大多数呈阴性,极少数细胞呈弱阳性。表明本实验造模成功。
运用寿聪胶囊防治后,学习记忆能力显著提高;脑组织病理损害明显减轻,正常神经元数目明显增多,软化灶大多的溶解吸收;ChAT阳性细胞数目显著增多,染色大多呈强阳性表达。其机制可能是寿聪胶囊抑制了D半乳糖所诱发自由基的过氧化损伤,通过上调ChAT的表达,拮抗了东莨菪碱所致的胆碱能神经系统的功能障碍,减轻脑组织的病理损害,增强了Ach与胆碱能M受体的亲和力,提高了突触传递的效率,从而减轻了AD大鼠学习记忆能力的下降。
本研究结果还表明,寿聪胶囊高剂量组的ChAT阳性表达和脑组织的保护作用优于脑复康。可能与寿聪胶囊的中医药整体调节、病证结合、多靶点作用的优势有关,量效关系有待于进一步的研究。
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2 张 晋,刘 荣,董 健,等.名老中医治疗老年性痴呆经验评述〔J〕.中医药信息,2001;18(3):12.
3 徐叔云,卞如濂,陈 修.药理实验方法学〔M〕.北京:人民卫生出版社,1994:152086.
4 王颖彦,王 健,周如倩,等.老年性痴呆动物模型及其评价〔J〕.中国临床药理学与治疗学,2004;9(3):24952.
5 董洪涛,白 英.多因素阿尔茨海默病动物模型的建立及针刺对其海马胆碱酯酶活性的实验研究〔J〕.上海医学,2002;25(7):4279.
6 赖世隆,胡镜清.中医药防治老年性痴呆研究中几个关键问题的思考〔J〕.广州中医药大学学报,2000;17(2):1005.
7 张 晋,刘 荣,董 健,等.名老中医治疗老年性痴呆经验评述〔J〕.中医药信息,2001;18(3):12. |