| 一种人硫氧还蛋白基因修饰肝细胞的制备 |
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TTGACTAATTCATTAATGGTGGCTT C-3′。异硫氰酸胍一步法从143(TK-)人骨肉瘤细胞中提取模板RNA。应用锚定引物oligo(dT) 15逆转录合成cDNA第一条链，聚合酶链反应(PCR)扩增hTrx cDNA基因，插入载体质粒pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM/hTrx，并进行基因序列测定。质粒的制备、纯化、酶切、连接及转化按常规方法进行。
1.2 含hTrx基因的重组逆转录病毒载体的构建
大量制备逆转录病毒载体pLEGFP-N1(购自Clontech公司)，将其和pGEM/hTrx分别行BglⅡ、BamHⅠ联合酶切、回收、连接。筛选鉴定含hTrx基因的重组质粒pLEGFP/hTrx。
1.3 重组逆转录病毒的制备
运用磷酸钙共沉淀转染法进行重组逆转录病毒的制备。取pLEGFP/hTrx，电泳定量约1 g/L。加入2.5 mol/L CaCl2，加至复苏的PA317细胞(胚胎成纤维细胞)表面，可见细密沉淀钙粒形成。37 ℃下CO2培养箱内培养8 h，加入含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液，置37 ℃培养箱内72 h。2.5 g/L胰酶消化后按1：3传代，质量浓度为400 μg/mL的G418(一种氨基糖苷类抗生素)筛选高表达细胞株。14 d时有多个抗性克隆形成，细胞克隆单瓶培养至抗性细胞形成单层，消化传代后，加入DMEM培养液(不含G418)培养;收集细胞上清液进行病毒浓缩纯化。加入预冷饱和硫酸铵， 透析纯化浓缩，经0.22 μm微孔滤膜除菌处理。
1.4 重组逆转录病毒滴度测定
复苏NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维样细胞)，铺满培养瓶后，2.5 g/L胰酶消化，培养接种于24孔培养板。将制备的多组病毒液均相应作104、105和106倍稀释接种在细胞表面;37 ℃，5%体积分数CO2条件下培养72 h，荧光显微镜下观察每孔含荧光的细胞数，
Seppen J， Filali EE， Elferink RO. Small animal models of hepatocyte transplantation [J]. Methods Mol Biol， 2009， 481(8)： 75-82.
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