核糖体S6激酶对肝星状细胞内胶原表达的调控


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核糖体S6激酶对肝星状细胞内胶原表达的调控

核糖体S6激酶对肝星状细胞内胶原表达的调控

作者：杨妙芳，许小兵，吴文娟，张晓华，朱人敏

【摘要】 目的：探讨核糖体S6激酶（p90RSK）调节肝星状细胞（HSC）Ⅰ型胶原表达的作用. 方法：将设计的p90RSK特异性siRNA克隆至真核表达载体pAVU6+27中，构建p90RSK的RNA干扰真核表达载体pAVRSKi. 将构建的pAVRSKi通过脂质体瞬时转染HSCT6，分别采用实时定量聚合酶链式反应和Western Blot方法检测细胞的p90RSK和Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达. 将p90RSK的真核表达质粒（pMT2RSK1）和pAVRSKi分别与Ⅰ型胶原启动子荧光素酶报告基因质粒（pGL3COL1A1）共转染原代HSC，48 h后检测细胞的荧光素酶活性. 结果：构建的pAVRSKi能够有效抑制HSCT6中p90RSK mRNA和蛋白表达，与对照组相比较分别减少了（70.20±4.04）%和（89.10±5.26）%（P<0.01）. HSCT6中Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白的表达，与对照组相比较分别减少（61.80±3.96）%和（98.50±7.01）%（P<0.01）. 各组转染pMT2RSK1，pAVRSKi和空载质粒的HSC中，Ⅰ型胶原启动子活性之间的差异无统计学意义（P>0.05）. 结论： p90RSK参与了HSC中胶原的表达调控，可能成为肝纤维治疗的新靶点.

【关键词】 核糖体蛋白质S6激酶类；肝/细胞学；星形细胞；胶原Ⅰ型；RNA干扰

0引言

核糖体S6激酶（90KDa ribosomal S6 kinase, p90RSK）隶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase 1 and 2, ERK1/2）信号转导通路的重要效应分子，具有在多种细胞内调控基因转录、细胞周期以及维持细胞生存等生物活性［1-2］，在肿瘤的发生及神经系统发育中具有重要的调控作用［3］. 活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）是肝纤维化时细胞外基质的主要来源和发生、发展的中心环节［4］. 研究［5-6］表明p90RSK在肝纤维化中表达增加，并参与诱导HSC的凋亡. 然而p90RSK是否参与调节HSC内胶原的表达及其可能机制，目前国内外尚少见报道. 本实验采用RNA干扰、报告基因等技术，研究HSC内p90RSK调节胶原表达及其分子机制，为临床治疗肝纤维化提供新的思路.

1材料和方法

1.1材料雄性SD大鼠250～300 g（南京军区南京总医院实验动物中心）；pMT2RSK1由美国哈佛大学医学院Avruch教授惠赠. pAVU6+27由美国密歇根大学生物化学实验室Engelke教授惠赠. 携带大鼠Ⅰ型胶原启动子及萤火虫荧光素酶基因的pGL3COL1A1由东南大学实验中心提供. 肝星状细胞株HSCT6由美国西奈山大学肝脏中心实验室Friedman教授惠赠，其表型为活化的HSC. 小鼠抗大鼠RSK抗体（美国BD 公司）；兔抗大鼠Ⅰ型胶原抗体（武汉博士德公司）；荧光素酶检测试剂盒（美国Promega公司）；CK40型电转化仪，iCyclerTM 光学荧光定量PCR仪，PAC3000蛋白电泳仪，半干转膜仪（美国BIORAD公司）；CK40倒置显微镜（日本Olympus公司）；聚偏二氧乙烯膜（PVDF）（美国Schleicher & Schuell公司）；LipofectamineTM2000试剂（美国Invitrogen公司）；牛血清白蛋白（美国Sigma公司）.

1.2方法

1.2.1HSC原代细胞的分离培养大鼠称重后以戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后，以10 U/L肝素钠1 mL/kg将大鼠肝素化，暴露门静脉，插管，以37℃无钙灌流液预灌流，40

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