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作者：谢裕华 易春智 项晓伟 刘建仁
【摘要】 [目的]建立新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞体外培养的方法。[方法]选用出生后24h内的SD大鼠，分离大鼠大脑皮质细胞，加入含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，于倒置相差显微镜下观察细胞生长形态;取传代培养的第3代细胞，采用计数板计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长情况。[结果]从新生大鼠大脑皮质分离的细胞生长旺盛，星形胶质细胞形态典型，未见其他种类细胞生长。[结论]建立了一种简单易行的大鼠星形胶质细胞体外培养方法。
【关键词】 星形胶质细胞/病理学 细胞培养 体外的 大鼠
星形胶质细胞功能广泛，在神经系统发育、突触传递、神经系统内环境的稳定和新陈代谢等中枢神经系统的多种正常生理活动，以及神经疾病的病理机制中都起着十分重要的作用[1],神经胶质细胞是构成神经组织的两大类细胞之一，也是神经组织内的一种支持成分，其生物学作用受到重视。近年来发现星形胶质细胞除参与神经元与毛细血管间的物质运输以及神经组织损伤时分裂增殖胶质疤痕的形成外，也有营养神经及抑制神经生长的功能[2-3]。本实验建立了一种培养新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的方法,以期为神经胶质细胞膜功能蛋白质组学的研究建立基础。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物 新生24h的SD大鼠2只，由广东省实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤)20030001。
1.2 主要试剂及仪器 高糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶均由Hyclone公司提供;DHanks(美国Simga公司);其他试剂均为国产分析纯。23232型CO2恒温培养箱(Sheldon Manufactruing.Inc，USA);3k15低温离心机(美国Sigma公司);DLCJIF超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司);MPS 60倒置显微镜(Leika DMIRB);超纯水系统(MILLPORE，SAS 67120MOISHEMA，France);佳能A630数码相机;550型酶标仪(BIORAD公司)。
1.3 星形胶质细胞的原代培养 取新生SD大鼠(生后24h内)，断颈处死后浸入体积分数75%乙醇中消毒。以血管钳从后夹住颈部，用眼科剪从枕部向前依次分开头皮及颅骨，再用眼科镊依次剥离，剔除脑膜及血管。取大脑(剔除海马部分)置于DHanks液中，用镊子撕碎成糜状，眼科剪反复剪10min，用移液枪轻轻吹打20～30次，用1.25g/L的胰蛋白酶消化15min，然后以含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化，1 000r/min离心10min去上清后重新加入含血清培养基，吹打均匀，将细胞悬液接种至底壁面积为25cm2的培养瓶中，接种密度为1×106个/cm2，置培养箱中，37℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养，第2天待细胞贴壁后换液1次并去除死细胞，以后每2～3d换液1次，细胞长成致密单层后进行传代培养。
1.4 传代培养 细胞生长了8～10d后,在显微镜下可见细胞长满瓶底90%。向每个培养瓶中加入1.25g/L的胰蛋白酶1mL消化3～4min，消化时在显微镜下密切观察,防止消化过度导致细胞死亡。待细胞脱壁后,用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化。将细胞悬液移入10mL离心管中,以1000r/min离心10min去上清后重新加入含血清培养基，吹打均匀，将细胞悬液接种至底壁面积为25cm2的培养瓶中，接种密度为1×106个/cm2，置培养箱中，37℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养,每2～3d换液1次，待细胞长满瓶底90%以上时再次进行传代培养。
1.5 细胞生长情况
1.5.1 计数板计数 将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。吸出少许细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min。镜下观察，计算计数板4大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：n细胞(个·mL-1)=n细胞总数/ 4×10 000。镜下偶见由2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散 [1] [2] [3] 下一页 |
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