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本文由中国论文联盟联系的首要因素[4]。从理论上来说，应用抗氧化剂对于该病的预防和 治疗 应有较好的效果。中药复方丹参注射液是丹参、降香两味中药经提取精制而成，其有效成分是丹参酮,它可扩张冠状动脉，抑制血小板聚集及直接清除氧自由基并能改善微循环而增加组织供血供氧，降香能行气祛瘀，被广泛应用于冠心病、心绞痛、心肌炎、肺心病、糖尿病等[5，6]的活血化瘀治疗。由于PE属“血瘀”的范畴,中医临床上常可采用活血化瘀的中药对其进行治疗。采用中药丹参治疗时通过改善母体内NO 、PGI2 、ET和TXA2 的病理状况,起到一定的血管舒张作用,用药后可使血压明显下降、症状明显减轻[7]。本实验采用滋养细胞来源的JEG-3 细胞在细胞水平上进行复方丹参抗氧化作用的基础研究，为临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞和试剂来源JEG-3细胞株购自北京协和细胞资源中心。复方丹参注射液由正大青春宝药业有限公司生产，批号为Z33020177,每支10 ml，每毫升含丹参和降香各1 g。RP1640培养基为Gibco公司产品，Trizol购自Invitrogen 公司。胎牛血清为天津TBD生产。MTT购自Sigma公司，蛋白裂解液、活性氧(ROS)、丙二醛(MAD)及超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。定量PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix 购自TOYOBO 公司，定量PCR 仪：ABI PRISM 7300 Sequence Detection System，定量PCR 反应体系为ABI公司产品，紫外/可见分光光度计LAMBDA 45为PerkinElmer 公司产品，全自动(荧光)酶标仪为TZCAN-SAFIRQ-2 奥地利TZCAN公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养JEG-3 细胞在含10 %胎牛血清的RP1640培养液37℃、5 % CO2条件下培养传代,初始接种密度为5×104 /cm2，待细胞融合时,将JEG-3细胞根据所加丹参终浓度分4组(以下复方丹参简称DS)：对照组、DS1、DS2、DS3，DS终浓度(参照 文献 [8，9])分别为0，1.25，2.50 mg/ml和12.50 mg/ml。将各组JEG-3细胞用含0.1%的牛血清白蛋白的RP1640培养基(不含血清)培养24 h，次日，加入5 mmol/L H2O2共孵育3h以诱导氧化应激[10]。然后以PBS洗3次以备后续分析。
1.2.2 MTT法检测细胞存活率将JEG-3细胞置96孔板经复方丹参和H2O2预处理后，向各组每孔内加入5 mg/ml的 MTT 20μl，置于37℃条件下孵育4 h，吸弃上清液，加入100μl二甲基亚砜，振荡数分钟，用全自动酶标仪(波长为490 nm)测定每孔OD值。
1.2.3 DCFH-DA法测细胞内ROS水平ROS检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内ROS的水平。本实验将JEG-3细胞置48孔培养板经DS和H2O2预处理后，实验当天，吸除培养液，PBS洗涤细胞后，无血清培养基稀释的终浓度为10μmol/L的DCFH-DA 在37 ℃、5 %CO2 条件下培养20 min，按ROS检测试剂盒说明用荧光酶标仪测荧光密度(FI)值。
1.2.4 MDA及SOD活性的检测将JEG-3细胞置25 cm2培养瓶经DS和H2O2预处理后，吸弃培养液，用碧云天生产的蛋白裂解液裂解细胞，收集裂解液，-70℃冻存待测。按试剂盒说明书操作，分光光度计及酶标仪检测。
1.2.5 SOD-mRNA (荧光定量RT-PCR)分析将JEG-3细胞置6孔板经DS及H2O2预处理后，吸弃培养液，收集细胞，加入1ml Trizol溶液，吹打混匀，使细胞充分裂解，收集裂解液， 采用Trizol 一步法抽提组织总RNA。取1μl RNA样品50倍稀释，在Beckman Coulter DU 520UV/Vis Spectrophotometer 上测定OD 值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA 较纯,无蛋白质污染。取RNA样品1μl，1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5srRNA,18srRNA和28srRNA 条带，3条条带完整，即可证明总RNA抽提比较完整。取总RNA 1μg,根据试剂盒(Promega产品)提供方法以随机引物逆转录合成模板cDNA。定量PCR采用50μl ABI 体系,共进行40个循环,每个样重复3次。内参片段：18SrRNA-112bp，目的片段SOD: 201bp，设计的引物：qh-SOD-F2：5'CTCAGGAGACCATTGCAT，qh-SOD-R2：5' CAGCTAGCAGGATAACAGAT , 计算 机软件分析各反应的荧光强度,参照标准曲线得出SOD-mRNA的相对值。
1.3 统计学处理用SPSS11统计软件进行分析，所有数据以±s表示，进行方差分析。
2 结果
2.1 MTT法检测细胞的存活数如表1所示，复方丹参注射液(1.25，2.50 mg/ml)预处理的滋养细胞，H2O2氧化损伤后,与对照组 (0 mg/ml)比较，随丹参浓度增加，OD值呈上升，即细胞存活数增加。而高浓度丹参(12.50mg/ml [1] [2] 下一页 |
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