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作者：吴敏华，周维顺，谢长生
【摘要】 ：［目的］ 观察抗肺癌合剂对C57BL/6小鼠Lewis肺癌的抑制作用，并从分子水平观察其对肿瘤组织VEGF表达的影响。［方法］ C57BL/6近交系小鼠50只，造模后，抗肺癌合剂（低、中、高3个剂量）、生理盐水、CTX分别作用于动物模型。15d后处死所有动物，剥取瘤组织称重，并计算抑瘤率；应用免疫组化法及图像分析技术检测瘤组织VEGF表达的积分光密度。［结果］ 在平均瘤重上，中药高剂量组与模型组有显著性差异（P<0.05）；在肿瘤组织VEGF表达上，中药高剂量组与模型组有显著性差异（P<0.05）。［结论］ 抗肺癌合剂能抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长，并能降低Lewis肺癌小鼠肿瘤组织VEGF表达。
【关键词】 肺肿瘤；血管内皮生长因子；中医药治疗
Abstract： ［Objective］ To study the effect on the growth of mouse Lewis lung carcinoma and on the expression of VEGF in tumor tissue. ［Methods］ C57BL/6 mice were inoculated the Lewis lung carcinoma cell at right armpit and divided into groups. Different groups were administered by MAALC (low, normal and high dose), CTX or saline. After 15 days, all mice were put to death to detach the tumors then weighed them. After that, we treated tumor tissue with VEGF immunohistochemistry stain, detected the integral optical density of VEGF expression with image analytical technique. ［Results］ Compared with model group, the average weight and VEGF expression level of the tumors of the high dose group were less and statistically significant (P<0.05). ［Conclusion］ MAALC can restrain the growth of Lewis lung carcinoma，and can degrade the expression level of VEGF in tumor tissue.
Key words: lung neoplasms; VEGF; TCM therapy
肺癌是目前最常见的恶性肿瘤，近年其发病与死亡呈明显上升趋势，严重危害人民健康，对其防治任重道远。诸多研究表明，中医药在抗肿瘤生长与转移，对放化疗的增效减毒，提高机体免疫功能，改善症状、提高生存质量上有其自身的优势。抗肺癌合剂是周维顺教授通过长期临床实践创立的经验方，主要用于肺癌病人，并在临床使用中取得了较好的疗效，为进一步验证其效果，并初步探讨其可能的作用机制，本研究从动物实验角度, 观察抗肺癌合剂对C57BL/6小鼠Lewis肺癌的抑制作用，并从分子水平观察其对肿瘤组织VEGF表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
六周龄C57BL/6近交系小鼠50只，雌雄各半，体重（17.02±1.81）g，清洁级，均由浙江中医药大学实验动物中心代购。Lewis肺癌瘤源小鼠由浙江省中医药研究院馈赠。
1.2 实验药物和试剂
抗肺癌合剂（白花蛇舌草、半枝莲、猫人参、猫爪草、野荞麦根、生黄芪、北沙参等16味中药组成）水提取至高剂量组浓度为每毫升含生药3g，4℃冰箱保存备用。中剂量、低剂量组临用时由高剂量组用蒸馏水稀释至浓度为每毫升分别含生药1.5 g和0.75 g。注射用环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，200mg/支，批号：05081821）用时以生理盐水临时配制成浓度为2 mg/ml。小鼠抗鼠VEGF单克隆抗体、PV6001/6002 PowerVisionTM TwoStep免疫组化染色试剂盒、ZLI9032浓缩型DAB试剂盒（购自北京中杉金桥生物技术有限公司）。
1.3 实验造模
参照文献［1］造模，将接种Lewis肺癌的瘤源小鼠脱颈椎处死，消毒后置于超净台上，剪开小鼠腋下皮肤，取新鲜肿瘤组织并剪成约1mm3碎块，置于匀浆器中研磨，并以200目滤膜过滤到无菌烧杯内，加生理盐水稀释成1:3的瘤细胞悬液。用移液枪吸取细胞悬液约20μl置于无菌试管内，用生理盐水稀释100倍，加0.2%台盼兰染色后，吸取少许置于细胞计数板上，放于低倍显微镜下观察，计算活细胞数。以生理盐水稀释，调整细胞悬液浓度为1×107个瘤细胞/ml。50只C57BL/6小鼠右腋皮下各接种瘤细胞悬液0.2 ml。接种24h后，随机分成5组：模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、环磷酰胺组，每组各10只。
1.4 给药方法
造模后第2天开始给药，给药剂量参照陈奇推荐的药量换算法［2］，中药高、中、低剂量组每天分别予相当于生药120g/kg、60g/kg和30g/kg的抗肺癌合剂灌胃；模型组每天以生理盐水灌胃；灌胃容积为0.4ml/10g，均连续灌胃14d。CTX组隔天腹腔注射1次CTX，剂量为20 mg/kg/天［3］，共6次。
1.5 观察抑瘤率及瘤组织VEGF表达
各组小鼠分别于实验第15d处死，取瘤组织称重，根据公式：抑瘤率%=（C-T）/C×100%（T为实验组的平均瘤重，C为模型对照组的平均瘤重），计算抑瘤率。SP二步法制备肿瘤组织免疫组化病理切片。参考Kraan［4］等方法对免疫组化染色切片细胞浆表达的VEGF进行定量分析。采用Leica QWin Standard V2.8自动图象分析系统，以VEGF阳性表达的平均积分光密度作为统计指标［5］。积分光密度＝平均光密度×阳性面积。 1.6 统计学方法
用SPSS13.0统计软件分析处理。计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示。多组间均数的比较用方差分析，每两组间均数比较采用q检验。以P<0.05为显著性差异，P<0.01为非常显著性差异。
2 结果
2.1 平均瘤重和抑瘤率
实验中，1只实验小鼠死于CTX毒性反应，1只死于灌胃操作。各组小鼠平均瘤重和抑瘤率如表1。由表1可见，中药高剂量组抑瘤率达29.8%，平均瘤重与模型对照组相比有显著性差异(P<0.05)；中药低、中剂量组平均瘤重与模型组无显著性差异（P>0.05）。表1 各组小鼠平均瘤重(x±s)和抑瘤率（略）
2.2 肿瘤组织VEGF表达
各组小鼠接种部位瘤组织VEGF阳性表达的平均积分光密度如表2。从表2可见在肿瘤组织VEGF表达的平均积分光密度上，中药高剂量组与模型对照组比较有显著性差异（P<0.05）；中药低、中剂量组与模型组比较无显著性差异(P>0.05)。表2 各组小鼠肿瘤组织VEGF表达的平均积分光密度(略)
3 讨论
肺癌属于中医“肺积”、“息贲”等范畴。气（气滞）、痰（痰凝）、瘀（血瘀）、毒（毒聚）、虚（正气亏虚）是其基本病因。肺癌患者多表现为气阴两虚、邪毒内聚，临床多以清热解毒、益气养阴为主要大法辨证论治。抗肺癌合剂由猫人参、猫爪草、半枝莲、蛇舌草、野荞麦根、生黄芪、女贞子、南沙参、北沙参、灵芝、茯苓、薏苡仁等16味中药组成。全方配伍精良，以清热解毒治其实，益气养阴治其虚，辅以健脾和胃、顾护胃气，祛邪而不伤正，标本兼顾，体现中医辨证论治的原则，在临床应用中收效良好。
VEGF是1989年Ferrara等［6］从牛垂体滤泡星状细胞的体外培养液中纯化出来并命名的，它是肿瘤血管生成过程中最关键的调控因素［7］。当VEGF 信号被抑制时，肿瘤生长将被破坏［8］。因此，VEGF的测定在判断预后、筛选转移高危病例、指导治疗及疗效判断方面具有重要价值。
本实验表明，抗肺癌合剂能抑制肿瘤的发生和生长，其抗癌能力与药物剂量呈一定的相关性，其机制可能与下调肿瘤组织VEGF的表达有关。本实验结果与临床疗效有较好的一致性，为抗肺癌合剂的临床应用提供了实验依据，也为进一步开发该复方提供了实验基础。但本实验中，抗肺癌合剂各剂量组只有高剂量组有一定的抗肿瘤作用，中、低剂量组抗瘤作用不明显，可能与实验样本含量小，药物浓度低有关。在今后实验中，有必要扩大样本含量，增加给药浓度，改良药物剂型，并进行体外实验进一步研究抗肺癌合剂的抗肿瘤作用及主要机制。
【参考文献】
［1］徐叔云.药理实验方法学［M］.第3版，北京:人民卫生出版社,2002:17671770.
［2］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社,1993:3336.
［3］徐叔云.药理实验方法学［M］.第3版，北京:人民卫生出版社,2002:1762.
［4］Kraan MC,Smith MD,Weedon H, et al. Measurement of cytokine and adhesion molecule expression in synovial tissue by digital image analysis［J］.Ann Rheum Dis, 2001, 60: 296298.
［5］于萍,步宏,王华,等.免疫组化结果的图像分析与人工计数方法的对比研究［J］.生物医学工程学杂志, 2003, 20（2）: 288290.
［6］Ferrar N, Henzel WJ. Pituitary follicular cell secrete anovel heparinbinding growth factors pecific for vascular endothelial cells ［J］.Biochem Biophys Res Commun, 1989, 161（2）: 851.
［7］Brattsrom D, Bergqvist M, Hesselius P, et al. Elevated preoperative serum levels of angiogenic cytokines correlate to large primary tumors and poorer survival in nonsmall cell lung cancer patients［J］. Lung Cancer, 2002, 37（1）: 57.
［8］Tian X, Song S, Wu J, et al. Vascular endothelial growth Factor:acting as an autocrine growth factor for human gastric adenocarcinoma cell MGC803［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 286（3）: 505512. |
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