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作者：尹丽慧，叶爱芳，熊术道，韩义香，章圣辉，吴建波
【摘要】 ：［目的］观察苦瓜蛋白对K562/A02细胞多药耐药的逆转及对Pgp 表达、功能的影响。［方法］采用CCK8法测IC50，用流式细胞仪测定苦瓜蛋白对K562/A02细胞上Pgp 表达及细胞内ADM潴留的影响。［结果］苦瓜蛋白能提高K562/A02对多种化疗药物敏感性，使Pgp蛋白表达下降，提高细胞内ADM的浓度。［结论］苦瓜蛋白能部分逆转K562/A02的耐药性，逆转机制与下调Pgp蛋白的表达有关。
【关键词】 白血病；苦瓜蛋白；多药耐药;P糖蛋白
Abstract：［Objective］ To explore effect of momordin on reversion of multidrug resistance (MDR) in K562/A02 cells, and expression and function of Pglycoprotein (Pgp ). ［Methods］ IC50 was detected by CCK8, and expression of Pgp and retention of ADM in K562/A02 cells were detected by flow cytometry (FCM). ［Results］ Momordin can improve sensitivity of K562/A02 cells to many kinds of chemotherapeutical drugs, result in decrease of expression of Pgp, and raise concentration of ADM within cells. ［Conclusion］ Momordin can partly reverse drug resistance of K562/A02 cells, the mechanism of reversion is related with down regulation of expression of Pgp.
Key words: leukemia; momordin; multidrug resistance; Pglycoprotein
白血病细胞对化疗药物产生多药耐药(MDR)是临床上白血病患者化疗失败和复发的主要原因，而多药耐药基因（MDR1）编码的细胞膜糖蛋白P170过度表达，导致细胞毒药物从肿瘤细胞内外渗，使肿瘤细胞内药物浓度下降是MDR最常见，最主要的发生机制。因此，通过采用对Pgp的调节，抑制其过度表达，从而使肿瘤的MDR发生逆转或部分逆转，将对临床肿瘤患者的治疗有非常积极的意义。苦瓜蛋白是从苦瓜种子中分离出来的一种碱性蛋白，属于I型核糖体失活蛋白，研究表明，其能显著抑制肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡，具有较强的抗肿瘤作用［12］，但目前有关苦瓜蛋白逆转MDR的研究国内外少有报道，本研究观察其对K562/A02细胞耐药性的影响，期望为白血病MDR治疗寻找一种新的药物。
1 材料
1.1 细胞株 K562 上海中科院细胞库；K562/A02 中国医学科学院血液学研究所。苦瓜蛋白是本实验室提取［3］，RPMI1640 美国 GIBCO公司；胎牛血清天津市正江高科技有限公司；100 青霉素链霉素双抗液 美国GIBCO公司；阿霉素和柔红霉素 浙江海正药业股份有限公司；长春新碱 广州明兴制药有限公司；柔红霉素 浙江海正药业股份有限公司；CCK8 日本同仁化学研究所；荧光标记单抗 BD公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人红白血病细胞株K562及耐药株K562/A02用含10%FBS，100U青、链霉素的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，长满后按悬浮细胞常规传代法进行传代培养。
1.2.2 细胞毒性试验
取对数生长期细胞，按1×105/ml接种96孔板，24h后分组加入实验药物，每组6复孔，继续培养48h，加入CCK8，37℃孵育1h，酶标仪测OD值，计算细胞增殖抑制率，IC50，耐药倍数和逆转倍数，以抑制率不大于10%的药物浓度作为逆转浓度，耐药倍数=耐药细胞的IC50/敏感细胞IC50，逆转倍数=耐药细胞IC50/逆转后耐药细胞的IC50。
1.2.3 苦瓜蛋白对K562/A02细胞表面Pgp表达的影响
取对数生长期细胞，按1×105/ml接种于24孔板，分为对照组和苦瓜蛋白组，药物作用48h后，每个样本收集细胞2×105个细胞，PBS洗一次，重悬于100μlPBS液中，阴性对照组加入10μl的Mouse IgG2α，其余各组加10μl的Pgp PE，室温避光孵育20min，PBS洗一次，加1%多聚甲醛250μl，FACS Calibur型流式细胞仪检测。
1.2.4 苦瓜蛋白对K562/A02细胞胞内药物浓度的影响：
取对数生长期细胞，按1×105/ml接种于24孔板，分为对照组和苦瓜蛋白组，药物作用24h后，加入10μg/ml的ADM孵育1h，PBS洗2次，加1%多聚甲醛250μl，流式细胞仪检测。
1.2.5 统计学分析
检验结果以x±s表示，样本均数比较采用t检验，P<0.05为统计学差异有显著性。
2 结果
2.1 苦瓜蛋白对K562/A02细胞毒性试验
苦瓜蛋白能够抑制K562/A02细胞生长，抑制作用随着药物剂量的增加而增强，呈明显的剂量依赖关系，见图1。48h的IC50为20.9μg/ml，2μg/ml 和5μg/ml的苦瓜蛋白对K562/A02的抑制率分别为4.2%和9.9%，我们选择以5μg/ml作为逆转剂量。
2.2 苦瓜蛋白对K562/A02药敏性的影响
K562/A02细胞对多种化疗药物耐药，耐药倍数从28.7～152.2，见表1。5μg/ml的苦瓜蛋白联合化疗药物共同作用于K562/A02细胞，能使细胞对多种化疗药物的IC50下降，逆转倍数分别为4.0～6.5倍，见表2。表1 K562/A02细胞的耐药程度（略）表2 苦瓜蛋白对K562/A02细胞耐药的逆转作用（略）
2.3 苦瓜蛋白对K562/A02细胞表面Pgp表达的影响
流式细胞仪检测显示，K562细胞不表达Pgp蛋白，K562/A02细胞表面 Pgp蛋白高表达，表达率为（94.88±3.37%），5μg/ml苦瓜蛋白处理后细胞表面Pgp表达下降明显，表达率为（80.33±2.30%）（n=3）（P<0.01），下降了14.55%，见图2。
2.4 苦瓜蛋白对K562/A02细胞内药物浓度的影响
流式细胞仪检测ADM蓄积水平结果显示：K562/A02平均荧光强度（30.69±2.16）与K562细胞的（219.16±8.23）相比，明显下降（P<0.01），流式图上表现波峰左移，细胞平均荧光强度明显减弱，说明耐药的K562/A02细胞内药物平均浓度降低。经5μg/ml苦瓜蛋白处理48h后，波峰右移，细胞平均荧光强度增强（60.47±2.97）（P<0.01），说明苦瓜蛋白增加了ADM在耐药白血病细胞内的蓄积，细胞的耐药性部分得到纠正（图3）。
3 讨论
白血病MDR是白血病化疗的一大障碍，克服白血病MDR，提高抗癌药物疗效已经成为白血病治疗急待解决的关键性的课题。体外被证实具有逆转耐药活性的化合物或生物制剂有很多，如环胞霉素、异博定等，但因它们对心、肾的毒性，使其临床应用收到限制。目前，国内外学者正积极寻找高效、低毒、逆转效果显著的肿瘤耐药逆转剂。苦瓜在中国、东南亚、土耳其等地均有广泛的栽种和药用历史，《本草纲目》中记载，苦瓜具有“除邪热，解劳乏，清心明目”等功效。有研究表明，宫颈癌患者抗癌过程服用苦瓜45d～90d，其Pgp水平明显下降，而单纯化疗的患者无此项改变［4］。苦瓜蛋白是苦瓜的主要有效活性成分之一，其主要抗癌的作用机理是抑制DNA、RNA，从而抑制蛋白合成，我们猜想其可能具有抑制Pgp表达，逆转耐药的作用，因此，通过本实验研究对其进行探讨。
Pgp是ATP结合盒转运蛋白超家族中的成员之一，由两个序列高度相似的重复部分构成，通过消耗ATP将进入肿瘤细胞内的化疗药物主动泵除细胞外，减少细胞内药物蓄积，从而逃避抗癌药物的杀伤作用。K562/A02细胞是以Pgp蛋白升高为主要耐药机制的细胞株，它对多种化学结构和药理机制不同的临床常用抗癌药物有不同程度的耐药现象［5］。我们的实验结果也证实了K562/A02对ADM，VCR和DNR交叉耐药，耐药倍数从28.7～152.2倍不等。无毒剂量的苦瓜蛋白能够增强K562/A02细胞对VCR,ADM及DNR的敏感性，使其对上述药物的IC50明显下降，逆转倍数分别为6.5倍，5.4倍和4倍，表明苦瓜蛋白能部分逆转K562/A02细胞的耐药性。流式实验结果显示：苦瓜蛋白能抑制K562/A02细胞表面Pgp的表达，表达率下降了14.55%；进一步的ADM蓄积实验表明，苦瓜蛋白确实能明显增加K562内ADM的潴留，提示苦瓜蛋白逆转耐药与其抑制Pgp表达或抑制其功能，减少了ADM的外排有关。苦瓜蛋白具有RNA N糖苷酶的活性，抑制Pgp表达可能与其作用于真核细胞核糖体28S rRNA第4323为腺嘌呤糖苷键水解断裂，导致60S亚基失活，从而使蛋白质合成受到抑制有关。
苦瓜蛋白是从苦瓜中提取的有效活性成分，毒性小，本实验证实其确实具有显著逆转K562/A02耐药，逆转的部分机理与Pgp表达受抑有关。如果能进一步的在体内实验中证实苦瓜蛋白MDR逆转作用，并将其开发成新药，对克服白血病MDR、战胜白血病具有重要的理论和现实意义。
【参考文献】
［1］熊术道,尹丽慧,李景荣,等.苦瓜蛋白抗肿瘤作用及其分子机制［J］.中草药,2008,39(3):408411.
［2］郎海滨,糜漫天,程天民,等.苦瓜核糖体失活蛋白的纯化及其诱导HL60细胞凋亡的研究［J］.营养学报,2004,26(2):139142.
［3］熊术道,尹丽慧,李景荣,等.苦瓜籽RIP的分离纯化及其对K562细胞作用的研究［J］.中华中医药学刊,2007,25(1):8184.
［4］Pongnikom S,Fongmoon D,Kasinrerk W,et al. Effect of bittermelon(Mamordica charantial L inn) on level and function of natural killer cells in cervical cancer patients with radiotherapy［J］ J Med Assoc Thai,2003,86:6168.
［5］栾凤君,杨纯正,马建国,等.一株人红白血病多药耐药细胞系（K562/A02）的建立及其耐药特性的研究［J］.中华肿瘤杂志,1993,15(2):101102. |
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