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作者：周群芳, 鞠吉雨, 郎景和
【摘要】 目的: 制备抗人骨桥蛋白（hOPN）的单克隆抗体（mAb）, 用于其功能研究。方法: 构建OPN的原核表达载体pTriEx1hONP载体, 转化Tuner(DE3)placI 感受态大肠杆菌, 用IPTG进行诱导表达。利用镍柱亲和层析纯化OPN蛋白, 纯化蛋白经超滤浓缩洗涤后即为免疫原。以重组纯化的OPN蛋白为免疫原, 免疫BALB/c小鼠, 取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合, 通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选, 获得分泌鼠抗人OPN蛋白mAb的杂交瘤细胞株, 通过ELISA、 Western blot等方法检测其特异性, 并用免疫组化方法检测了正常月经周期子宫内膜OPN的表达。结果: pTriEx1hONP表达的OPN蛋白主要为可溶性形式, 经镍柱纯化后, 蛋白纯度可达85％以上。纯化的OPN重组蛋白免疫小鼠后经融合筛选, 得到2株稳定分泌抗人OPN的mAb杂交瘤细胞株, 分别命名为1E7和5B7, 两株mAb的免疫球蛋白亚类分别IgG1和IgG2a。通过ELISA和Western blot等方法鉴定, 抗OPN的mAb能与OPN蛋白特异性结合。通过免疫组织化学方法对不同时期的正常子宫内膜的OPN的检测表明, 子宫内膜腺上皮在增生期、 分泌早期, OPN呈 弱阳性表达; 分泌中、 晚期OPN呈强阳性表达。结论: 以纯化的重组hOPN为免疫原成功制备了鼠抗hOPN的mAb, 并初步进行了应用, 为研究hOPN的功能打下了良好基础。
【关键词】 骨桥蛋白; 原核表达; 单克隆抗体
骨桥蛋白（osteopontin, OPN）是一种机体反应性的多功能磷酸化糖蛋白, 具有精氨酸甘氨酸天冬氨酸（arginineglycineaspartic acid, RGD）序列, 可通过该序列与整合素和CD44结合, [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 下一页 |
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