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参与细胞的黏附、 迁移等［1］。OPN功能复杂多样, 与免疫系统、 肿瘤转移、 消化系统、 泌尿系统、 生殖系统、 骨组织等关系密切, 参与疾病的发生［2, 3］。近年来有学者发现子宫内膜、 蜕膜等生殖系统也表达OPN, OPN在胚胎的着床、 生长发育及分化等方面也起着重要作用, 因此OPN在生殖系统疾病中的作用值得近一步研究［4］。我们通过构建OPN的原核表达载体, 表达纯化OPN蛋白并制备小鼠抗人OPN蛋白单克隆抗体(mAb）, 用于OPN的检测, 以进一步研究OPN与生殖疾病的关系。
1 材料和方法
1.1 材料 克隆用大肠杆菌DH5α本室保存。表达质粒pTriEx1、 含人OPN cDNA的质粒pET28ahOPN及表达用大肠杆菌Tuner（DE3）placI由哈佛大学刘思金博士惠赠。6～8周龄的BALB/c小鼠（雌性）, 购自中国医学科学院动物所。
1.2 方法
1.2.1 表达载体的构建 根据OPN基因序列NCBI（Accession Number: NM_000582）设计一对扩增引物扩增人OPN基因编码序列全长: PCR上游引物P1为5′CGGGAGCTCCCAGATGCTGTGGCCACATG3′, 引入Sac I酶切位点, 下游引物P2为5′GTGCTCGAGATTGACCTCAGAAGATGCAC3′引入Xho I 酶切位点。扩增部分为 hOPNcDNA序列（Accession Number: NM_000582）的2741065位核苷酸。以pET28ahOPN为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃预变性 3 min, 然后94℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃ 1 min 循环, 共30个循环, 最后72℃延伸10 min, PCR产物用凝胶回收试剂盒回收后和pTriEx1均以Sac I和Xho I酶切并纯化, 二者用T4 DNA连接酶16℃连接过夜, 转化大肠杆菌DH5α, 将菌液涂布于含100 mg/L氨卞青霉素的LB平板, 筛选阳性克隆并进一步用PCR和测序 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 下一页 |
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