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进行鉴定。
1.2.2 OPN蛋白的诱导表达和纯化 挑取鉴定正确的pTriEx1hONP质粒转化大肠杆菌Tuner（DE3）placI, 挑取单个阳性克隆接种于含有5 mL LB培养基（含氨苄青霉素100 mg/L, 10 g/L的葡萄糖）中, 37℃ 250 r/min 摇菌至A值达0.5左右时, 加入浓度为1 mmol/L的IPTG, 诱导3 h后离心收集菌体, 同时在诱导前取样作为对照。收集的菌体经超声裂解后取上清和沉淀分别进行SDSPAGE电泳, 考马斯亮兰染色分析。按上述方法对pTriEx1hONP进行大量诱导表达蛋白, 取出培养物5 000 r/min离心收集细胞, 超声破碎细胞, 镍离子金属鳌合柱（NiNTA）纯化目的蛋白, 收集洗脱液, 经SDSPAGE鉴定后超滤管超滤浓缩洗涤后备用。
1.2.3 鼠抗人OPN mAb的制备 纯化后的OPN抗原与等体积的完全弗氏佐剂混合, 充分搅拌直至成为油包水, 腹部皮下多点注射。每只小鼠注射20 μg抗原, 共注射5只小鼠。2周后同剂量抗原加福氏不完全佐剂加强免疫, 加强免疫2次。后一次加强免疫7 d后以间接ELISA检测小鼠血清抗人OPN多抗的效价, 效价高者尾静脉再冲击免疫1 次, 每只20 μg, 3 d后进行细胞融合。将免疫小鼠的脾细胞悬液与体外培养的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞以5∶1的比例在聚乙二醇作用下按常规法融合, 采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆化培养。以重组纯化的人OPN蛋白作为抗原（0.4 mg/L）包被酶标96孔板, 间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清, 所测的A490比阴性对照高10倍的克隆, 进行亚克隆化, 并进行扩增冻存。经过3次有限稀释克隆化, 将分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系大量扩增并冻存, 长期传代培养后, 以相同的方法再次克隆化鉴定之。
1.2.4 mAb生物学特性的分析和鉴定 （1）mAb的Ig亚类鉴定: 取杂交瘤细胞培养上清液, 用Roch公司提供的IsoStripTM鼠mAb亚类检测试剂盒进行IgG亚类鉴定。具体操作过程按照说明书进行。（2）应用Western blot测定mAb的特异性。将纯化的重组人OPN和pT 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 下一页 |
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