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相符（图2）。测序结果显示目标序列与NCBI（Accession Number: NM_000582）相应序列相符, 证实表达载体pTriEx1hOPN构建成功。
2.2 hOPN融合蛋白的诱导表达及纯化 pTriEx1hOPN阳性菌株经IPTG诱导后SDSPAGE电泳显示: 在37℃、 1 mmol/L IPTG诱导3 h条件下, 融合蛋白表达达到高峰, 蛋白条带位于Mr约55 000处（比计算的Mr大）。该重组蛋白主要以可溶性形式存在, 用镍离子金属鳌合柱（NiNTA）层析柱纯化后, 蛋白浓度证实纯度在85%以上(图3)。 图1 OPN PCR扩增产物（略）
1: DNA marker DL 2000; 2: PCR扩增的人OPN片段.
图2 pTriEx1hONP酶切鉴定（略）
1: DNA marker(λDNA/Hind III+EcoR I); 2: Sac I和Xho I双酶切重组质粒pTriEx1hOPN.
图3 重组蛋白的SDSPAGE分析（略）
M: 蛋白质marker; 1, 2: pTriEx1转化Tuner（DE3）placI诱导前的上清和沉淀; 3, 4: pTriEx1转化Tuner（DE3）placI诱导后的上清和沉淀; 5, 6: pTriEx1hOPN转化Tuner（DE3）placI诱导前的上清和沉淀; 7, 8: pTriEx1hOPN转化Tuner（DE3）placI诱导前的上清和沉淀; 9: 纯化的OPN蛋白.
2.3 特异性分泌鼠抗人OPN mAb的杂交瘤细胞株的建立 按常规方法以重组人OPN蛋白为免疫小鼠后进行细胞融合, 将融合10块96孔培养板, 融合率约为85％。将复测为阳性的克隆连续3次克隆化培养, 获得2株持续分泌特异性抗人OPN mAb的杂交瘤细胞株, 分别命名为1E7和5B7。杂交瘤细胞株经体外连续传代培养, 液氮冻存半年后复苏, 仍生长良 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 下一页 |
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