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riEx1hONP转化Tuner（DE3）placI诱导后的菌体蛋白进行SDSPAGE电泳, 电转至PVDF膜上, 用50 g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜, 加入抗人OPN mAb, 室温反应1 h , TBST（0.1 mol/L Tris.Cl, pH7.5, 0.5 mL/L Tween20）缓冲液洗膜3次, 加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶10 000稀释）, 室温下孵育1 h, TBST洗涤3次。ECL法显色。（3）mAb效价的检测: 常规方法诱生小鼠mAb腹水, 离心取上清分装, 冻存于-70℃。应用Protein G免疫亲和层析法纯化mAb, 方法按Pharmaeia公司方法进行。以纯化OPN 10 mg/L包被酶标板, 常规间接ELISA方法检测纯化血清效价。（4）相加实验: 取上述包被好的抗原酶标孔, 取2株阳性单克隆孔的细胞培养上清为一抗, 进行间接ELISA反应, 测定反应显色后的A490值, 按公式计算它们的相加系数: AI=［2A1+2/(A1+A2)-1］×100%, 其中A1+2为相加孔吸光值, A1、 A2为非相加孔的吸光值。AI接近100%, 则2个mAb识别不同的抗原表位, AI接近0, 则2个mAb识别相同的抗原表位。
1.2.5 免疫组织化学方法检测子宫内膜OPN的表达 正常人子宫内膜经常规方法固定、 包埋、 切片、 脱蜡、 至水后, PBS洗3次, 30 mL/L H2O2甲醇溶液室温孵育10 min, PBS洗涤后微波抗原修复, PBS洗涤后加100 mL/L的山羊血清37℃封闭20 min, 加入杂交瘤培养上清, 4℃孵育过夜, PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP, 37℃孵育30 min, PBS洗片后进行DAB显色, 苏木素复染, 返蓝后封片。
2 结果
2.1 重组质粒pTriEx1hOPN的构建和鉴定 以pET28ahOPN为模板, 扩增人OPN的全长791 bp, 与预期结果相符（图1）。将hOPN亚克隆到原核表达载体pTriEx1多克隆位点中（Sac I和Xho I）。重组克隆经酶切及PCR鉴定, 目的片段大小与预期 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 下一页 |
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