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【摘要】 ：［目的］研究人参皂甙Rb1对应激大鼠肝脏HSP70（热休克蛋白质70）和PKC（蛋白激酶C）的影响及两者的关系。［方法］56只SD（SpragueDawley）大鼠分为人参皂甙组、生理盐水组、假手术组，均采用大鼠肝脏缺血再灌注制作应激模型，手术后于30min、60min及180min定点处死实验动物，收集肝脏标本，应用ELISA法测定大鼠肝细胞HSP70的表达及PKC的水平。［结果］人参皂甙30min组和60min组与生理盐水组比较，HSP70表达明显较高（P<0.05）；人参皂甙60min组PKC水平较生理盐水组高，有显著性差异（P<0.05）；大鼠肝脏的PKC水平与HSP70的表达进行线性回归分析显示两者呈显著的正相关。［结论］ 人参皂甙Rb1可以提高应激时大鼠肝脏HSP70的表达和PKC水平提高，且HSP70的表达与PKC水平的变化呈正相关。
【关键词】 人参皂甙Rb1；应激；热休克蛋白质70；蛋白激酶C
Abstract： ［Objective］ To study the effect of ginsenoside Rb1 on liver heat shock protein70 and protein kinase C and the relationship between the two factors.［Methods］ 56 SD(Sprague Dawley) rats were divided into 3 groups: ginsenoside group, saline group, shamoperated group. Put these rats to death at 30min, 60min and 180min, extract liver and draw blood, use the ELISA to analyze the expression of HSP70 and the level of PKC.［Results］ (1) To compare the level of PKC at different time points of ginsenosides and the saline group,60 min ginsenoside group is higher than the saline group. There is a significant difference(P<0.05). Comparison of ginsenosides and saline 30 min and 180 min is no significant difference(P>0.05). (2)To compare HSP70 at different time points of ginsenosides and the saline group, 30 min and 60 min ginsenoside groups are higher than the saline group. There is a significant difference(P<0.05). Comparison of ginsenosides and saline 180 min is no significant difference(P>0.05). (3)The linear regression analysis of the level of PKC and the expression of HSP70 show that two factors are in significant positive correlation.［Conclusions］ 1.Ginsenoside Rb1 can increase the expression of HSP70. 2.Ginsenoside Rb1 can increase the level of PKC.3.The movement of the expression of HSP70 and the level of PKC are in significant positive correlation.
Key words: ginsenoside Rb1；stress；heat shock protein70；protein kinase C
应激是指机体在受到各种强烈因素(应激原)刺激时所出现的非特异性全身反应，又称为应激反应。研究发现应激过程中产生的多种介质、应激激素和细胞因子可以通过直接或间接途径导致肝细胞的损伤和功能变化，从而影响机体的应激调节功能，进而影响机体的预后或转归。笔者于2007年7月至2008年1月，采用大鼠肝脏缺血再灌注制作应激模型，通过检测大鼠肝脏热休克蛋白70（HSP70）和蛋白激酶C（PKC）的变化，观察人参皂甙Rb1对应激时对HSP70和PKC的影响及两者的关系，从而探讨人参皂甙Rb1保护应激机体的机制是否与PKC有关。
1 材料和方法
1.1 实验动物
清洁级SD雄性大鼠56只，体重（200±15）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 主要试剂及仪器
人参皂甙Rb1粉针剂（上海同田生物技术有限公司）；HSP70 ELISA试剂盒、PKC ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；全自动酶标仪:SERIAL RS232C型（浙江中医药大学生物实验室）。
1.3 实验分组及造模
将大鼠分为人参皂甙组、生理盐水组、假手术组。根据Pringle′s 改良法造模：大鼠禁食不禁水12h，人参皂甙组尾静脉注射人参皂甙Rb1 1ml/kg，生理盐水组注射生理盐水1ml/kg，30min后腹腔注射10%水合氯醛0.4ml/100g（400mg/kg）麻醉。
1.4 实验方法
250u/ml肝素钠按2～4ml/kg静脉注射全身肝素化。将大鼠平卧位固定于手术台上，手术区备皮，PVP碘消毒，铺巾。常规手术操作沿腹白线作约2.5cm的切口,暴露肝脏,轻轻游离肝动脉、门静脉、胆总管,用无创伤微血管夹夹闭肝十二指肠韧带，阻断入肝血流,造成肝脏缺血, 30 min后松开微血管夹,恢复血供。术后立即于双侧腹股沟皮下各注射1ml生理盐水，以补充术中液体丢失。操作过程中所有动物腹腔注射37℃生理盐水10ml，以保持血液动力学的稳定。术后分别于30、60、180min处死后取肝脏标本，称重0.1g左右,放入匀浆器,加入细胞裂解液1ml,0℃冰浴环境中手工匀浆至肝脏组织完全磨碎溶解。将匀浆液倒入离心管，于4℃低温离心器离心（20000rpm，20min），吸取上清液，标记后置于-80℃冰箱内冷冻保存。
1.5 观测指标及检测方法
HSP70及PKC测定：酶联免疫吸附( ELISA)法测定,试剂购自武汉华美生物工程有限公司，严格按照试剂盒说明书操作。
1.6 统计方法
应用SPSS17.0统计软件包进行统计分析处理，实验数据以x±s表示，样本均数间两两比较用q检验（SNK法）。取双侧P<0.05为统计学有显著性差异。 2 结果
2.1 肝脏HSP70表达
模型组大鼠肝脏HSP70表达较假手术组明显增高，与假手术组比较有显著性差异（P<0.05），造模成功。人参皂甙30min组和60min组与生理盐水组比较，HSP70表达明显较高（P<0.05），说明人参皂甙Rb1在肝脏缺血再灌注后相应时间点能提高HSP70的表达。而180min两组比较无明显差异（P>0.05），说明人参皂甙Rb1在肝脏缺血再灌注后相应时间点对HSP70的表达效果不明显，详见表1。表1 人参皂甙Rb1对缺血再灌注大鼠肝脏HSP70含量的影响(略)
2.2 肝脏PKC水平
模型组大鼠肝脏PKC水平较假手术组明显增高，与假手术组比较有显著性差异（P<0.05），造模成功。人参皂甙60min组PKC水平较生理盐水组高，有显著性差异（P<0.05），说明人参皂甙Rb1在肝脏缺血再灌注后相应时间点能提高HSP70的表达。而30min和180min两组分别比较无明显差异（P>0.05），说明人参皂甙Rb1在肝脏缺血再灌注后相应时间点对PKC的水平影响不明显，详见表2。表2 人参皂甙Rb1对缺血再灌注大鼠肝脏PKC水平的影响(略)
2.3 肝脏HSP70与PKC水平的相关性分析
静注人参皂甙大鼠肝脏PKC水平随着时间点总体变化呈V字形，而肝细胞HSP70的表达总体也呈V字形。利用SPSS17.0做出PKCHSP70拟合曲线见图1。对HSP70和PKC进行线性回归分析，结果表明： PKC 与HSP70呈显著正相关。
3 讨论
HSP是一组高度保守的蛋白质，是细胞内一种内源性具有保护作用的物质，能增强机体或细胞对于打击的耐受。其中HSP70在热休克、微生物感染及自身免疫性疾病等应激条件下具有重要的细胞保护作用［1］。HSP70对肝脏损伤的保护作用表现在：（1）氧化损伤的保护；（2）缺血再灌注的保护；（3）抗细胞凋亡；（4）抗炎作用。本研究结果显示,造模后各组大鼠肝脏HSP70 的表达先后升高，与文献报道一致［23］。PKC是属丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶的多基因超家族［4］，是肌醇磷脂系统的中心酶，它可使大量的底物磷酸化而广泛参与保护性蛋白质的合成、细胞的生长分化、细胞的分泌等作用的生理调节。Yang等［5］研究发现缺血可以促使某些内源性物质释放,这些物质包括儿茶酚胺、氧自由基、腺苷等,它们作用于细胞膜上的特异性受体,通过G蛋白的介导,激活磷脂酶C或D,使磷脂酰肌醇二磷酸或肌醇磷脂胆碱水解,引起二酰基甘油生成及细胞内Ca2+浓度增高,从而激活PKC。PKC激活后产生的保护作用是某些效应蛋白磷酸化的结果。ATP依赖的钾通道、5′核苷酸酶、热休克蛋白和丝裂素活化蛋白激酶等有可能成为PKC的底物。本研究结果显示：而大鼠PKC水平变化与HSP70的表达变化根据线性回归分析呈显著的正相关，表明人参皂甙Rb1促进HSP70表达的机制与PKC有关。
人参主补五脏,安精神,大补元气,生津止渴,可挽救气脱危症及肺虚喘促、脾虚泄泻、消渴少津等一切虚症。人参增强免疫系统功能，促进生长发育，增强动物对外部或内部因素引起功能低下的抵抗力和适应性即抗应激作用与中医滋补强壮含义是接近的。现代药理学研究表明人参是适应原性药物，具有双向调节作用。 人参的双向调节作用是指向着有利于机体功能恢复和加强的方向进行调节。 这个结论与传统中医关于人参“扶正祛邪”的作用是相符的。
综上所述，肝脏是体内代谢的中心，又是重要的免疫器官，可以影响机体的应激调节功能，进而影响机体的预后或转归。HSP70是细胞内一种内源性具有保护作用的物质，增强机体或细胞对于打击的耐受。我们的实验表明，人参皂甙Rb1可以提高应激时大鼠肝脏HSP70的表达和PKC水平提高，且HSP70的表达与PKC水平的变化呈正相关。
【参考文献】
［1］赵祯,安冬艳,秦丽娟,等. HSP70在经热应激预处理后减少大鼠肝脏缺血再灌注损伤过程中的作用［J］. 中国药理学通报，2005,21(4):4547.
［2］Kano R , Abe K, Hasegawa A. cDNA of canine heat shock protein70(HSP70)［J］.Veterinary Research Communications,2004,28(5):395.
［3］罗东林,周继红,刘宝华,等.热休克蛋白70与严重多发伤后早期继发性肝脏损害［J］.中国危重病急救医学,2003,15(4):204.
［4］Carini R，DeCesaris MG，SPlendore R，et al.Signal pathway involved in the development of hypoxic preconditioning in rat hepatoeytes［J］.Hepatology，2001，33(1):131139.
［5］Yang XM, Sato H, Downey JM. Protection of ischemic preconditioning is dependent upon a critical timing sequence of protein kinase C action［J ］. Journal of Molecular and Cellular Cardiology, 1997, 29: 143151. |
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