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作者：王旭凯 王英 杨有庚 冷向阳
【摘要】 ［目的］探讨鹿茸多肽对β淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞凋亡的保护作用。［方法］体外进行胎鼠脊髓神经元细胞培养传代，细胞进入对数生长期后进行实验。MTT比色法检测不同浓度β淀粉样蛋白作用24 h后细胞活力变化；检测25μmol／L β淀粉样蛋白作用24 h后，细胞凋亡百分数和观察细胞caspase3表达情况。［结果］不同浓度的β淀粉样蛋白作用24 h后对细胞活力均明显下降，并呈剂量依赖性(P<0.05)；鹿茸多肽可明显抑制β淀粉样蛋白诱导的脊髓神经元细胞凋亡现象(P<0.05)，且可使caspase3的表达量下降。［结论］鹿茸多肽通过抑制β淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞caspase3表达增高而对其细胞凋亡发挥保护作用，本实验为探索新的治疗脊髓神经损伤的药物提供了重要的理论基础。
【关键词】 鹿茸多肽 脊髓神经细胞 细胞凋亡 β淀粉样蛋白 casepase3
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是外科常见的创伤，其年发病率逐年升高。在脊髓损伤中，除了原发的物理打击因素造成神经细胞损伤外，已发现损伤区及临近部位的神经细胞存在迟发性的死亡现象，这种死亡与常见的坏死不同［1］，表现为一种程序性死亡（细胞凋亡），细胞凋亡可能参与了脊髓损伤的病理生理过程。caspase3是凋亡过程中最重要的蛋白酶，降低其的表达有助于脊髓损伤的修复和再生［2］。鹿茸系鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角［3］。关于鹿茸多肽混合物，近两年，有学者通过实验证明鹿茸多肽对脊髓损伤后的神经细胞有保护作用［4］，本实验应用鹿茸多肽作用于β淀粉样蛋白诱导的脊髓神经元细胞凋亡的保护作用，以进一步阐述其对脊髓神经细胞保护作用的机理。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料 15d孕鼠购自吉林大学实验动物中心；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自invitrogen公司；细胞培养瓶和培养板购自Castar公司；神经生长因子（NGF）购自Sigma公司；鹿茸多肽由长春中医药大学惠赠；β淀粉样蛋白(Aβ25-35)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自(Sigma公司)；兔多克隆caspase3抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 凝聚态Aβ25-35的制备 用超纯水将冻干的Aβ25-35溶解配成100 μmol／L的储存液，于-20℃ 保存，使用前配成所需浓度，于37℃孵育24 h备用。
1.2.2 胎鼠脊髓细胞悬液制备及培养 取孕15d大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉后，无菌状态下取出胎鼠。用Hank’s液冲洗数遍后，放于培养皿中。在解剖显微镜下从背侧完全暴露脑干以下整条脊髓，从正中沟处用钨丝针切除双侧脊髓的后外侧部。将取下的脊髓腹侧组织，经Hank’s液冲洗后，剥去表面的血管等，用显微剪子细剪切成糜状，越细越好；然后用0.25%胰酶37℃消化20min后，用吸管轻轻吹打数次，经200目滤网过滤，离心弃上清，用含15%胎牛血清培养基以1×106/ml接种于塑料培养瓶中。
将细胞培养在含15%胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素及100U/ml链霉素的DMEM培养基中，于37℃、饱和湿度、5 %CO2浓度下培养，2～3d 换液一次。实验均取对数生长期细胞，实验前12 h细胞换用无血清培养液，观察不同浓度Aβ25-35的作用。
1.2.3 MTT比色法检测细胞活力 观察不同终浓度(0、5、10、20、25、30μmol／L)的Aβ25-35作用24 h后，细胞活力的变化，细胞接种于96孔板24 h后加入不同浓度的Aβ25-35作用24 h，每个浓度设4个复孔L，同时设与实验孔平行的空白对照，最后比色时以对照孔调零。共同孵育24 h后更换培养基，每孔加入180μl的培养基和20μl的MTT(5 mg／ml)，置37℃、5％CO2培养箱培养4 h，弃培养液，每孔加入200μl DMSO，37℃孵育30 min，至结晶物充分溶解。在多功能酶标仪上测定570nm的吸光度(D570)，其与对照吸光度的比值作为相对细胞活力。
1.2.4 流式细胞仪检测 将细胞接种于24孔板，待达到80％融合时，按下列分组进行实验：A.对照组，B. Aβ25-35（25μmol/L），C. Aβ25-35（25μmol/L）+鹿茸多肽（400mg/ml）［3］，D.照射Aβ25-35（25μmol/l）+NGF（20ng/ml）组。各组均6复孔。将24h以后各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min 离心5min，弃上清；用500μl 5mmol/L EDTA/0.01mol/L PBS洗涤细胞；再加入50μl 10g/L RNaseA，室温下孵育30min；最后加入500μl 100mg/LPI染色液，旋转混匀，置4℃避光孵育30min后，流式细胞仪测定。
1.2.5 免疫细胞化学染色 将1cm×lcm盖玻片经浸酸及消毒等处理后，放入24孔培养板中，加入10倍稀释的多聚赖氨酸液，置于CO2 孵箱中1h；弃去多聚赖氨酸液，用DMEM培养基洗一次，将各组细胞悬液分别接种于各孔，继续培养24h；弃去原培养液，用37℃预热的0.1mol/L PBS轻洗3次；余按免疫组织化学试剂盒说明操作。
1.3 统计方法 应用统计分析软件SPSS14.0分析数据，数据以均数±标准差(x±s)表示，两两比较采用t检验，P<0.05，有统计学意义。 2 结果
2.1 脊髓神经元细胞的培养及鉴定 单细胞悬液接种后第2d，细胞聚集成团状，第3d出现大量悬浮的neurosphere(约30～60个细胞)，而且neurosphere越来越多。到第7d细胞胞体十分饱满，轮廓清晰，有的细胞可见明显的鸟眼状细胞核，也有的细胞伸出树枝状突起，突起相互连成网络。用神经元特异烯醇化酶(NSE)标记神经元。镜下观察，可见实验组细胞胞体饱满，突起明显并连成网状。见图1。
图1 烯醇化酶(NSE)标记神经元（略）
2.2 MTT比色法检测细胞活力 MTT检测结果显示，不同浓度的Aβ25-35（0、5、10、20、25、30μmol／L)作用24h后，均可引起细胞活力下降，并呈一定的剂量依赖性(P<0.05)。本实验选择Aβ25-35 25μmol /ml剂量进行后续实验，见图2。
图2 MTT法检测Aβ25-35细胞活力的影响（略）
2.3 流式细胞仪检测结果 以400mg/ml剂量观察鹿茸多肽对Aβ25-35诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用，并用NGF作为对照。结果显示，Aβ（25μmol／L）+鹿茸多肽（400mg/ml）组细胞凋亡百分数是19.35±6.74与Aβ组凋亡百分数37.42±12.55比较，有显著性差异，P<0.05，其作用与Aβ（25μmol／L）+NGF阳性对照组凋亡百分数17.88±5.91比较无差异。见图3、表1。
表1 鹿茸多肽对Aβ诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用（略）
图3 鹿茸多肽对Aβ诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用（略）
2.4 免疫组化检测caspase3结果 caspase3阳性细胞胞质着棕色。结果显示：对照组无caspase3阳性染色的细胞；Aβ（25μmol／L）+鹿茸多肽（400mg/ml）组caspase3阳性细胞数减少，比单纯Aβ（25μmol／L）组少，其作用与NGF阳性对照组比较无差异，鹿茸多肽对脊髓细胞凋亡具有抑制作用。见图4。
a 对照组b Aβ组（25μmol／L）c Aβ（25μmol／L）+鹿茸多肽（400mg/ml）d Aβ（25μmol／L）+NGF（20ng/ml）
图4 鹿茸多肽对Aβ（25μM）诱导脊髓神经元细胞caspase3的表达的影响（略）
3 讨论
脊髓损伤的治疗是神经科学领域内一道尚未解决的难题，虽然人们采取了许多种方法促进损伤后的脊髓轴突再生修复，但存在许多限制因素，很难达到理想效果，许多学者进行了深入研究脊髓神经组织损伤后再生不良，其重要原因是伤后继发性损害不断加重所致，而细胞凋亡是继发性损伤的关键，抑制细胞凋亡是阻止或减少继发性损伤，保护神经功能的治疗所在。细胞凋亡相关基因包括：Caspases（半胱氨酸蛋白酶基因家族）、bcl2（B细胞淋巴瘤/白血病基因家族2）、p53等。Caspases家族对细胞，特别是神经元凋亡程序的启动具有核心作用。它直接水解激活与DNA断裂等凋亡特征性改变密切相关的蛋白，又称为死亡蛋白酶。迄今已发现14个家族成员，其中caspase3是凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路［5］。因此抑制caspase3的表达是成为探索的治疗途径之一。β淀粉样蛋白是淀粉样前体蛋白(βAPP)通过一定降解途径产生的［6］，其主要的活性片段为Aβ25-35，Aβ25-35可诱导细胞凋亡，本实验利用辐射诱导脊髓神经细胞凋亡，观察鹿茸多肽对脊髓神经细胞凋亡后caspase3表达的影响。
本实验结果显示：应用Aβ25-35诱导胎鼠脊髓神经元细胞凋亡后，在细胞中加400mg/ml鹿茸多肽后，通过MTT比色法检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞凋亡数目和免疫组化观察caspase3表达量下降，提示，鹿茸多肽具有抑制Aβ25-35诱导脊髓神经细胞凋亡的作用，其作用是通过调控凋亡基因的表达，即caspase3表达下调而实现的。本实验说明，鹿茸多肽主要是通过有效地降低死亡蛋白酶caspase3的表达量，进而抑制脊髓神经元细胞的凋亡起到保护脊髓神经元细胞的作用。
【参考文献】
［1］ Emery E, Aldana P, Bunge MB, et al. Apoptosis after traumatic human spinal cord injury［J］.Journal Of Neuosurgery,1998, 89(6): 911920.
［2］ Springer JE,Azbill RD,Knapp PE, Activation of the caspase3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury［J］. Nature Medicine,1999, 5（8): 943946.
［3］ 王本祥,周秋丽.鹿茸的化学、药理及临床研究进展［J］. 药学学报,1991, 26(9) : 714720.
［4］ 冷向阳.鹿茸多肽对辐射诱导脊髓神经细胞凋亡的保护作用［J］.中国实验诊断学,2007,11(3):319321.
［5］ Daigle I, Simon HU.Critical role for caspases3 and8 in neutrophil but not eosinophil apoptosis［J］. International Allergy And Immunology, 2001,126(2): 147156.
［6］ 孙治坤,杨红旗,陆国强,等.促红细胞生成素对β淀粉样蛋白诱导细胞凋亡的保护作用［J］. 上海交通大学学报(医学版), 2007,27(10):11771180. |
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