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作者：王旭凯 王英 杨有庚 冷向阳
【摘要】 ［目的］探讨鹿茸多肽对β淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞凋亡的保护作用。［方法］体外进行胎鼠脊髓神经元细胞培养传代，细胞进入对数生长期后进行实验。MTT比色法检测不同浓度β淀粉样蛋白作用24 h后细胞活力变化；检测25μmol／L β淀粉样蛋白作用24 h后，细胞凋亡百分数和观察细胞caspase3表达情况。［结果］不同浓度的β淀粉样蛋白作用24 h后对细胞活力均明显下降，并呈剂量依赖性(P<0.05)；鹿茸多肽可明显抑制β淀粉样蛋白诱导的脊髓神经元细胞凋亡现象(P<0.05)，且可使caspase3的表达量下降。［结论］鹿茸多肽通过抑制β淀粉样蛋白诱导脊髓神经元细胞caspase3表达增高而对其细胞凋亡发挥保护作用，本实验为探索新的治疗脊髓神经损伤的药物提供了重要的理论基础。
【关键词】 鹿茸多肽 脊髓神经细胞 细胞凋亡 β淀粉样蛋白 casepase3
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是外科常见的创伤，其年发病率逐年升高。在脊髓损伤中，除了原发的物理打击因素造成神经细胞损伤外，已发现损伤区及临近部位的神经细胞存在迟发性的死亡现象，这种死亡与常见的坏死不同［1］，表现为一种程序性死亡（细胞凋亡），细胞凋亡可能参与了脊髓损伤的病理生理过程。caspase3是凋亡过程中最重要的蛋白酶，降低其的表达有助于脊髓损伤的修复和再生［2］。鹿茸系鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿未骨化密生绒毛的幼角［3］。关于鹿茸多肽混合物，近两年，有学者通过实验证明鹿茸多肽对脊髓损伤后的神经细胞有保护作用［4］，本实验应用鹿茸多肽作用于β淀粉样蛋白诱导的脊髓神经元细胞凋亡的保护作用，以进一步阐述其对脊髓神经细胞保护作用的机理。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料 15d孕鼠购自吉林大学实验动物中心；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自invitrogen公司；细胞培养瓶和培养板购自Castar公司；神经生长因子（NGF）购自Sigma公司；鹿茸多肽由长春中医药大学惠赠；β淀粉样蛋白(Aβ25-35)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自(Sigma公司)；兔多克隆caspase3抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 凝聚态Aβ25-35的制备 用超纯水将冻干的Aβ25-35溶解配成100 μmol／L的储存液，于-20℃ 保存，使用前配成所需浓度，于37℃孵育24 h备用。
1.2.2 胎鼠脊髓细胞悬液制备及培养 取孕15d大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉后，无菌状态下取出胎鼠。用Hank’s液冲洗数遍后，放于培养皿中。在解剖显微镜下从背侧完全暴露脑干以下整条脊髓，从正中沟处用钨丝针切除双侧脊髓的后外侧部。将取下的脊髓腹侧组织，经Hank’s液冲洗后，剥去表面的血管等，用显微剪子细剪切成糜状，越细越好；然后用0.25%胰酶37℃消化20min后，用吸管轻轻吹打数次，经200目滤网过滤，离心弃上清，用含15%胎牛血清培养基以1×106/ml接种于塑料培养瓶中。
将细胞培养在含15%胎牛血清、100U/ml氨苄青霉素及100U/ml链霉素的DMEM培养基中，于37℃、饱和湿度、5 %CO2浓度下培养，2～3d 换液一次。实验均取对数生长期细胞，实验前12 h细胞换用无血清培养液，观察不同浓度Aβ25-35的作用。
1.2.3 MTT比色法检测细胞活力 观察不同终浓度(0、5、10、20、25、30μmol／L)的Aβ25-35作用24 h后，细胞活力的变化，细胞接种于96孔板24 h后加入不同浓度的Aβ25-35作用24 h，每个浓度设4个复孔L，同时设与实验孔平行的空白对照，最后比色时以对照孔调零。共同孵育24 h后更换培养基，每孔加入180μl的培养基和20μl的MTT(5 mg／m [1] [2] [3] 下一页 |
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