|
l)，置37℃、5％CO2培养箱培养4 h，弃培养液，每孔加入200μl DMSO，37℃孵育30 min，至结晶物充分溶解。在多功能酶标仪上测定570nm的吸光度(D570)，其与对照吸光度的比值作为相对细胞活力。
1.2.4 流式细胞仪检测 将细胞接种于24孔板，待达到80％融合时，按下列分组进行实验：A.对照组，B. Aβ25-35（25μmol/L），C. Aβ25-35（25μmol/L）+鹿茸多肽（400mg/ml）［3］，D.照
射Aβ25-35（25μmol/l）+NGF（20ng/ml）组。各组均6复孔。将24h以后各组细胞用0.25%胰蛋白酶消化，1000 r/min 离心5min，弃上清；用500μl 5mmol/L EDTA/0.01mol/L PBS洗涤细胞；再加入50μl 10g/L RNaseA，室温下孵育30min；最后加入500μl 100mg/LPI染色液，旋转混匀，置4℃避光孵育30min后，流式细胞仪测定。
1.2.5 免疫细胞化学染色 将1cm×lcm盖玻片经浸酸及消毒等处理后，放入24孔培养板中，加入10倍稀释的多聚赖氨酸液，置于CO2 孵箱中1h；弃去多聚赖氨酸液，用DMEM培养基洗一次，将各组细胞悬液分别接种于各孔，继续培养24h；弃去原培养液，用37℃预热的0.1mol/L PBS轻洗3次；余按免疫组织化学试剂盒说明操作。
1.3 统计方法 应用统计分析软件SPSS14.0分析数据，数据以均数±标准差(x±s)表示，两两比较采用t检验，P<0.05，有统计学意义。 2 结果
2.1 脊髓神经元细胞的培养及鉴定 单细胞悬液接种后第2d，细胞聚集成团状，第3d出现大量悬浮的neurosphere(约30～60个细胞)，而且neurosphere越来越多。到第7d细胞胞体十分饱满，轮廓清晰，有的细胞可见明显的鸟眼状细胞核，也有的细胞伸出树枝状突起，突起相互连成网络。用神经元特异烯醇化酶(NSE)标记神经元。镜下观察，可见实验组细胞胞体饱满，突起明显并连成网状。见图1。
图1 烯醇化酶(NSE)标记神经元（略）
2.2 MTT比色法检测细胞活力 MTT检测结果显示，不同浓度的Aβ25-35（0、5、10、20、25、30μmol／L)作用24h后，均可引起细胞活力下降，并呈一定的剂量依赖性(P<0.05)。本实验选择Aβ25-35 25μmol /ml剂量进行后续实验，见图2。
图2 MTT法检测Aβ25-35细胞活力的影响（略）
2.3 流式细胞仪检测结果 以400mg/ml剂量观察鹿茸多肽对Aβ25-35诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用，并用NGF作为对照。结果显示，Aβ（25μmol／L）+鹿茸多肽（400mg/ml）组细胞凋亡百分数是19.35±6.74与Aβ组凋亡百分数37.42±12.55比较，有显著性差异，P<0.05，其作用与Aβ（25μmol／L）+NGF阳性对照组凋亡百分数17.88±5.91比较无差异。见图3、表1。
表1 鹿茸多肽对Aβ诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用（略）
图3 鹿茸多肽对Aβ诱导脊髓细胞凋亡的抑制作用（略）
2.4 免疫组化检测caspase3结果 caspase3阳性细胞胞质着棕色。结果显示：对照组无caspase3阳性染色的细胞；Aβ（25μmol／L）+鹿茸多肽（400mg/ml）组caspase3阳性细胞数减少，比单纯Aβ（25μmol／L）组少，其作用与NGF阳性对照组比较无差异，鹿茸多肽对脊髓细胞凋亡具有抑制作用。见图4。
a 对照组b Aβ组（25μmol／L）c Aβ（25μmol／L）+鹿茸多肽（400mg/ml）d Aβ（25μmol／L）+NGF（20ng/ml）
图4 鹿茸多肽对Aβ（25μM）诱导脊髓神经元细胞caspase3的表达的影响（略）
3 讨论
脊髓损伤的治疗是神经科学领域内 上一页 [1] [2] [3] 下一页 |
用户登录 
新用户注册 