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A的表达
151肾组织RNA的提取取肾组织块（约100mg）置匀浆器，加Trizol1mL，冷冻匀浆，转置于15mLEppendorf 管，加入氯仿02mL，盖紧盖子，用力摇动15s，15℃～30℃孵育2～3min，4℃、12 000r/min离心15min；取上清液至另一个15mLEppendorf管，加与上清液等容积的异丙醇，15℃～30℃孵育样品10min，4℃、12 000r/min离心10min
；弃上清液，体积分数75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃、7 500r/min离心5min；弃乙醇，空气或真空干燥5～10min（不要完全干燥），加焦碳酸二乙酯水（DEPC）溶解RNA，-80℃保存备用。若长期保存，加入25倍容积乙醇，置-80℃保存。
152引物的设计和合成采用ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成。引物和探针由中山大学达安基因诊断中心合成并纯化。序列如下：TGFβ1：Forward Primer:5’CGGAATACAGGGCTTTCGATT3’；Reverse Primer:5’GCTGATCCCGTTGATTTCCA3’；TaqMan Probe:5’FAMAGCGCTCACTGCTCTTGTGACATAMRA3’。GAPDH（内参照基因）：Forward Primer:5’TGTGTCCGTCGTG GATCTGA3’；Reverse Primer:5’TGCCTGCTT CACCACCTTCT3’；TaqMan Probe:5’FAMTGCCGCCTGGAGAAACCTG CCTAMRA3’。
153逆转录反应取4μLRNA模板做逆转录反应，反应体系如下：5倍逆转录buffer4μL［逆转录buffer成分为50mmol/L Tris HCl(pH80)、50mmol/L KCl、4mmol/L MgCl2、10mmol/L二硫苏糖醇（DTT）］，上游引物（10pmol/μL）04μL，下游引物（10pmol/μL）04μL，dNTPs（10mmol/L）05μL，MMLV反转录酶（200U/μL）1μL，DEPC97μL，RNA模板4μL，总体积为20μL。反应条件：37℃、1h，然后95℃、3min。
154荧光定量PCR反应以下反应均由PCR扩增仪扩增完成。反应体积为50μL，反应体系：5倍定量PCR buffer 10μL，上游引物F（10pmol/μL）1μL，下游引物R（10pmol/μL）1μL，dNTPs 05μL，荧光探针1μL，Taq 酶15μL，互补DNA（cDNA）5μL，重蒸水（ddH2O）30μL［PCR buffer成分为10mmol/L TrisHCl(pH80)、50mmol/L KCl、2mmol/L MgCl2］。反应条件：93℃、2min，93℃、45s， 55℃、45s，共40个循环。
16免疫组化法检测各组小鼠肾组织TGFβ1含量采用免疫组化链霉亲和素—生物素过氧化物酶复合物（SABC）法。取免疫组化的肾组织切片，置于显微镜下，计数10个肾小球，光学放大400倍，图像经全自动图像分析系统处理，应用阳性单位（positive unit，PU）的计算公式计算阳性单位的数值，以各组的PU值进行比较。pPU=100%×(Ga-GA)/［(1-Aa)×Gmax］。注：Ga为阳性反应的平均灰度级；GA为整个视野的平均灰度；Aa为阳性反应的面积密度；Gmax为设定的灰度最高级（所用的是256），所有数据均由系统自动算出。
17统计学方法采用SPSS 110统计软件进行统计分析。 2结果
21IgAN动物模型模型组小鼠尾静脉注射SEB后，死亡2只小鼠，其他小鼠均有不同程度的神态萎靡、皮毛蓬乱、反应性下降、食量减少等现象；而正常对照组小鼠活动度、反应性、进食量等均未见明显异常。模型组抽样测定小鼠24h尿蛋白定量为（1172±442）mg/d，显著高于正常对照组的（554±146）mg/d（P ＜001）。光镜见模型组小鼠肾小球体积轻度增大，系膜细胞和基质中、重度增生，部分 上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页 |
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