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本文由中国论文联盟
Key words： cajal interstitial cells ; detrusor overactivity; partial bladder outlet obstruction; bladder
膀胱逼尿肌的兴奋和收缩可受神经、体液等多种因素的调控和影响。目前的研究表明，膀胱平滑肌的兴奋调控可能与一种特殊的间质细胞，卡哈尔间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）有关[1]。ICC首先在胃肠道组织中发现，其细胞膜上带有特异性的ckit受体酪氨酸激酶的表面标记。ICC对胃肠道基本电节律的形成、神经传导的调控、信号整合等多种生理功能起到了重要的作用[2]。目前，在胃肠道组织以外的多种平滑肌组织（如输尿管、膀胱、子宫、胆囊等）陆续发现了ICC的存在[3～4]，但是胃肠道外ICC的功能学研究尚处于起步阶段。
逼尿肌不稳定(Detrusor Overactivity， DO)是常见的膀胱功能障碍， 临床上常表现为一种以尿急症状为特征的征候群，常伴有尿频和夜尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁；尿动力学上可表现为膀胱储尿期的膀胱不稳定收缩。根据2002年国际尿控协会的定义，DO在尿动力学的描述中为充盈期出现无意识的逼尿肌自发或经诱发的收缩[5]。
DO常伴发于膀胱流出道梗阻的患者。然而相当一部分患者在机械梗阻病因解除后排尿功能障碍并未得到有效缓解，提示逼尿肌不稳定的发病机制还有待进一步研究。既往的很多研究中关于神经调控异常和逼尿肌自身的结构变化等假说也不能满意的解释DO的发病原因[6]，而ICC在膀胱中的发现和初步研究表明，膀胱ICC在调节膀胱的局部收缩和逼尿肌自发性兴奋中可发挥重要的作用，因此，基于膀胱ICC的相关研究可能是对DO等膀胱功能障碍性疾病发病机制的重要补充。
本研究建立膀胱流出道部分梗阻（Patial bladder outlet obstruction，PBOO）致DO模型，通过免疫荧光标记的方法，比较ICC在PBOO膀胱中形态结构的差异，为进一步认识DO的发病机制打下一定基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂 健康雌性豚鼠，体重320～460 g，3～4月龄，购自第三军医大学动物实验中心。激光共聚焦显微镜（Leica公司），RM6240多通道生理检测仪（成都仪器厂），微量输液泵（3M公司），羊抗豚鼠ckit多克隆抗体（Santa cruz公司），大鼠抗豚鼠平滑肌肌动蛋白(SMM)单克隆抗体（Sigma公司），驴抗羊AF488荧光二抗、驴抗大鼠AF594荧光二抗（Molecular Probes公司），DAPI细胞核染料（碧云天公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 豚鼠膀胱流出道部分梗阻模型建立 参照Kubota[7]等人的实验方法构建豚鼠DI模型。简述如下：1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，将直径为1 mm 的硬膜外导管经尿道外口插入膀胱，以此作为尿道支撑。取下腹部正中切口，长约1.5～2 cm，切开皮肤及皮下组织，剪开腹直肌前鞘腱膜，分离腹直肌，找到膀胱，仔细游离膀胱-尿道交界处，近端尿道稍作分离，于此处穿过2-0丝线，结扎近端尿道，结扎丝线的松紧标准以牵拉探子时周围组织可随之移动，而探子又可轻易拔除为度，然后拔除探子，逐层缝合关闭切口。假手术组动物按照上述手术方法行开腹及近端尿道钝性分离，但不行结扎梗阻实验，作为对照。术后每只豚鼠单笼喂养，保持动物笼清洁干燥。所有实验动物术后适量使用抗生素：庆大霉素0.5 mg/kg，腹腔注射，1次/d，共3 d。
1.2.2 豚鼠膀胱尿动力学检测 PBOO手术4周后行尿动力学检测。25%乌拉坦溶液按1 g/kg 体重腹腔内注射麻醉。豚鼠取仰卧位，四肢固定，乙醇消毒尿道外口及会阴部，将外直径为1 mm 的硬膜外导管经尿道外口插入膀胱 (见尿液流出)；若为PBOO后模型豚鼠，可打开腹腔解除梗阻后再行插入。 轻压豚鼠腹部，排尽尿液，导管接5号针头，经三通管与尿动力检测仪及微量灌注泵相连。设置测压参数：压力模式，扫描速度10 s/div，灵敏度12.5 cmH2O，时间常数直流，采集频率400 Hz，滤波频率30 Hz；标定零点。用微量灌注泵以0.2 ml/min 速率灌注，膀胱灌注液采用生理盐水，同步记录随容积增加膀胱压力波形、膀胱容量以及排尿间隔时间。
1.2.3 豚鼠膀胱组织铺片和冰冻切片免疫荧光染色 在标本制作中使用组织冰冻切片和组织全层铺片两种方法，前者主要观察黏膜下ICC；而后者主要用于观察肌层的ICC。组织铺片的制作方法为：断颈处死动物，下腹部正中切口暴露膀胱，结扎双侧输尿管，将4％多聚甲醛自尿道注入膀胱内，维持充盈状态并固定10 min。将充盈的膀胱剪下置入4％多聚甲醛中继续固定6～8 h 后，沿腹侧面纵行剪开，在解剖 [1] [2] 下一页 |
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