［Key words］ Helicobacter pylori；HspA subunit；cloning, organism; gene order

    幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是上消化道的重要致病菌之一，其感染与B型胃炎和消化性溃疡的发生密切相关，并被世界卫生组织列为胃癌发生的相关致病菌［1］。在Hp的免疫 治疗 研究方面，纯化的尿素酶（Ure）和热休克蛋白（Heat shock protein，Hsp）及其亚单位成分均可作为抗原免疫动物刺激机体产生保护性的免疫防御和治疗作用［2，3］，其中，以Hsp为抗原的疫苗可使70%～80%的试验小鼠获得保护［4］。Hp是一种微需氧的革兰阴性杆菌，体外生长时对外部环境及支持物的要求十分苛刻。目前通过细菌培养获得大量Hp，并从中纯化出足量的亚单位抗原非常困难。基因工程亚单位疫苗能克服这些不足，已成为Hp疫苗研究的主攻方向，目前寻找高效抗原、适合载体及合理的免疫途径是疫苗研究的焦点。pGEX-4T-1原核表达载体是谷胱苷肽巯基转移酶（GST）融合表达系统，是一种极好的基因表达和纯化系统。pGEX-4T-1位于tac启动子上，能用化学方法诱导高效表达产生融合蛋白；基因表达时，表达产物是GST与目的基因的融合体，而载体多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。 黄琛等［5］已将Hp CagA蛋白肽段的基因克隆到pGEX表达载体，获得了很好的表达。目前尚未见将pGEX-4T-1载体引入到Hp HspA亚单位疫苗研究中的报告。2003-2004年运用PCR技术扩增人Hp HspA基因，插入原核表达载体并对其进行基因序列分析和同源性比较，为处于探索阶段的Hp HspA亚单位疫苗的研制提供一条选择途径。

    1  材料与方法

    1.1  菌株和质粒

    Hp，E.coil  DH5a 和原核表达载体pGEX-4T-1由曹承华硕士惠赠。

    1.2  主要试剂

    水解酪蛋白琼脂Mueller-Hinton Agar购自杭州微生物试剂厂，两性霉素B、多黏菌素B、万古霉素购自华美生物公司，磺胺增效剂（TMP）购自贵阳制药二厂，Taq DNA聚合酶、dNTP、T4DNA连接酶、限制性内切酶EcoR1、Xho1购自上海Sangon；Plasmid Isolation kit、Gel Extraction kit购自Omega公司。

    1.3  方法

    1.3.1  Hp培养及鉴定  无菌操作方法接种液体菌液于新鲜的含抗生素的M-H血平板上，将血平板放入厌氧罐内，同时放入能产生混合微需氧气体的试剂，37 ℃电热恒温培养箱中孵育3～5 d。用菌落、细菌形态及生化反应（尿素酶、触酶和氧化酶试验）对培养物进行鉴定。

    1.3.2  Hp染色体DNA的提取  按照试剂盒说明书操作。

    1.3.3  HspA的PCR扩增

    1.3.3.1  PCR引物设计与合成  根据 文献 报告，设计1对引物，上游引物P1 5’-CGG AAT TCA TGA AGT TTC AAC CAT TAG-3’，引入EcoRI限制性内酶酶切位点，并保留了起始密码子ATG；下游引物P2 5’-CCG CTC GAG TTA GTA TTT TTT GTG ATC-3’，引入XhoI限制性内酶酶切位点，并保留了终止密码子TAA。引物经 计算 机分析软件Primer分析，由上海生工公司合成。

    1.3.3.2  PCR反应条件  在PCR反应管中加入DNA模板、4种dNTP混合液、上下游引物及Taq DNA 聚合酶等进行PCR扩增。循环条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min,共35次循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃冷却终止反应。PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭 5 mg/L）电泳进行检测。

    1.3.4  pGEX-HspA重组质粒的构建及鉴定  用Omega公司的胶回收试剂盒回收纯化新鲜的PCR产物（操作步骤按试剂盒说明书进行）。将纯化后的PCR产物用EcoR1+Xho1进行双酶切，1.5%琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收。挑取单个含质粒pGEX-4T-1的细菌菌落接种入含氨苄青霉素（Amp）的LB培养液中培养后，提取质粒DNA，EcoR1＋Xho1进行双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收。最后将均经过酶切纯化过的HspA PCR产物和pGEX-4T-1在T4DNA连接酶的作用下进行连接（总体积10 μl，16 ℃连接16 h），构建pGEX-HspA重组质粒。将连接产物转化E.coil DH5a感受态细胞，挑取具有Amp抗性的菌落于含Amp的LB培养液中37 ℃振摇过夜培养，抽取质粒，用EcoR1+Xho1双酶切进行鉴定。

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