|
作者：王彬彬，陈培丰，舒琦瑾
【摘要】 ：［目的］寻找参麦注射液抗癌症恶病质的表达差异基因。［方法］建立结肠腺癌26荷瘤鼠癌症恶病质模型，随机分为两组后分别予等剂量的生理盐水、参麦注射液治疗。观察饮食量、体重、瘤体积变化等。第16d处死小鼠后取瘤。分别抽取各组瘤组织总RNA，应用Illiumina全基因组表达谱芯片（Mouse6 BeadChip），对差异表达基因进行分析探讨。［结果］参麦组恶病质小鼠去瘤体重明显重于空白对照组（P<0.01）；饮食量下降速度明显低于空白对照组（P<0.01）；与空白对照组对比，筛选得到参麦组差异表达基因共68条，其中56条呈上调趋势，12条下调，这些基因多数是小鼠肌cDNA文库中的基因，部分与代谢、免疫功能相关基因相关。［结论］参麦注射液有一定改善癌症恶病质的作用。其干预作用可能主要是通过调控小鼠肌肉组织以及与代谢、免疫功能等相关基因表达来实现的。
【关键词】 癌症恶病质；参麦注射液；差异基因；基因芯片
Abstract：［Objective］To detect the relevant differentially expressed genes of cancer cachexia(CC) induced by Shenmai injection in mice that carried colonic adenocarcinoma cells (colon26) with genechip technology. ［Methods］ Established colon26 CC mouse model, then randomly divided the mice into two groups and treated these mice with saline or Shenmai injection separately. Physiological conditions, body weight and tumor bulk were documented onca a day. To obtain the tumor tissue, all mice were executed on the 16th day. Total RNA extracted from the tumor tissue was submitted to Illumina Mouse6 BeadChip for whole genome gene expression profiling analysis. BeadStudio software was used to screen the differentially expressed genes between the two groups. ［Results］The decrease rate of diet quantity in the Shenmai group was significantly lower than that in the control group（P<0.01）, and the nontumor body weight of the Shenmai group was significantly heavier than that in the control group（P<0.01）. Sixtyeight differently expressed genes were identified between the Shemmai injection group and control group. Among these genes, fiftysix genes were upregulated and twelve genes were downregulated. Most of these genes belonged to the mouse muscle cDNA library and were related with immunity and metabolism of tumor. ［Conclusion］Shenmai injection can ameliorate CC by regulating these genes that associated with immunity and metabolism. Whole genome expression profiling DNA microarray is a powerful tool for identification of differently expressed genes.
Key words: cancer cachexia; Shenmai injection; differentially expressed genes; DNA microarray
癌症引起的恶病质即癌性恶病病质(cancer cachexia, CC)，是指晚期癌症患者的体重下降、厌食、虚弱、贫血、衰竭等体内代谢异常等组成的一组临床综合征，是癌症患者常见的并发症和死亡原因［1］。但由于对癌性恶病质发生机制仍不十分清楚，当前常规治疗尚不能明显改善恶病质患者的生存质量，且价格较昂贵，较大地增加了社会和家庭的经济负担。我们选用临床上广泛用于治疗中晚期肿瘤的中药制剂参麦注射液作为切入点，运用基因芯片技术，结合生物信息学手段，研究中药抗肿瘤恶病质的基因表达谱，从分子生物学水平探讨其药效作用的物质基础及作用机理。
1 材料与方法
1.1 动物与瘤株
健康雄性BALB/c小鼠48只，68周龄，体重2022g，由浙江中医药大学动物中心提供。结肠腺癌colon26细胞荷瘤鼠2只，由上海医药工业研究院药理室提供。
1.2 药品
参麦注射液由正大青春宝药业有限公司生产，国药准字：Z33020021，生产批号：0805152。
1.3 芯片材料和设备
Illumina激光共聚焦微珠芯片系统平台(BeadArray)、BeadSation扫描仪、BeadStudio分析软件、Mouse6 beadchip由上海博星基因芯片有限公司提供，产品目录号a21003。
1.4 动物实验方法
在超净工作台上剖取接种14d的皮下移植瘤，按50mg瘤组织:0.1ml无菌生理盐水的比例稀释后，无菌研磨器中制成单细胞悬液，调整到活瘤细胞浓度约为2×106个/ml，在每只小鼠右腋皮下注射 0.2ml瘤细胞悬液。第2d随机分为两组，参麦组M1为30只，空白对照组K2为18只。参麦组按32ml/kg.d予腹腔内注射参麦注射液，空白对照组予等量生理盐水腹腔注射，连续14d。接种后定时监测小鼠活动及毛色等一般状况的变化、小鼠体重、摄食量、饮水量，瘤体积等情况。第16d杀鼠取皮下移植瘤，迅速液氮冻存备用。
1.5 基因实验方法
1.5.1 芯片处理
用Unizol与组织分别充分混匀，迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，改良的一步法抽提肿瘤样本的总RNA［2］，采用Ambion Illumina RNA Amplification Kit线性扩增试剂盒对两样本进行线性扩增后得到纯化的cRNA，将样本与GEXHBY杂交液和无RNA酶的水混合，进入芯片杂交阶段。在杂交时掺入荧光标记SACy3（Fluorlink Cy3）对两样本进行标记，用StreptavidinCy3染色检测，然后清洗芯片,离心甩干。
1.5.2 检测与分析
用BeadSation对染色标记后的芯片进行扫描，获取芯片灰度扫描图。
1.5.3 数据处理
所有的数据均用Illumina BeadStudio Application软件进行分析，可以得到芯片上每个基因点的原始信号值，即所有有效重复点的前景信号值减去背景信号值的平均信号值（Avg_Signal），以及信号探测P值（Detection Pval），差异分值（Diffscore）等。差异基因的筛选标准为实验组与对照组其中任何一组中为有效基因，且实验组Diffscore值(即差异分值，体现一个探针在两种组织中的表达差异程度大于+20或小于-20，两值分别对应上调与下调，以及任意一个pvalue值小于0.01，即为差异基因。
1.6 统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理，数据用均数±标准差（x±s）表示，利用t检验、方差分析等统计方法分析动物实验部分数据。以P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果
2.1 参麦注射液对小鼠癌症恶病质的作用
皮下接种第4d，荷瘤小鼠右侧腋下开始可以触及小结节，至第9d，全部小鼠饮食量明显下降，进入典型恶病质期，其中以空白对照组症状特别明显。参麦组摄食量和饮水量下降速度明显低于空白对照组，第15d比第5d两组摄食量和饮水量下降速度分别为24.7%、52.5%及40.2%、45.9%(P<0.01)；第16d参麦组去瘤体重明显重于空白对照组（P<0.01），但两组间瘤体积比较无显著差异(P>0.05)，见表1。表1 参麦注射液对恶病质小鼠观察指标的影响(略)
2.2 总RNA提取结果
检测总RNA质量, 通过BioAnalyzer进行分析鉴定，需要有清晰的28s、18s和5s rRNA条带，同时28S和18S比值在2∶1以上，70℃水浴保温1h后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。电泳结果证实已抽提到高纯度的总RNA，质量完好，非降解，见图1。
2.3 基因表达谱
以Cy3荧光标记后，为表达谱芯片荧光扫描图像，结果分别见图2、3所示。图1 电泳图图2 空白组荧光标记扫描图图3 参麦组荧光标记扫描图2.4 差异表达的基因结果 运用Illunima激光共聚焦微珠芯片系统筛选参麦注射液治疗BALB/c小鼠癌症恶病质与空白对照组的差异表达的基因，共得到68条差异表达基因，信息来源为MEMBORefseq，绝大多数对应小鼠肌cDNA文库（cDNA library）。其中56条呈上调趋势，12条呈下调趋势。列举其中部分差异显著的5条差异基因列表，见表2。表2 参麦注射液基因芯片部分差异表达（略）
3 讨论
现代中医学研究提示：发生癌症恶病质后气阴两虚型明显增多（约占55.73％），是恶病质的主要证型［3］。本实验所使用的药物参麦注射液具有益气固脱、养阴生津等功效，临床上常用于治疗中晚期肿瘤，有较好的疗效［4］。我们尝试用基因芯片工具在基因水平初步提示中医药干预癌症恶病质的机制，就用生物信息学对差异表达基因进行分析，找出中药发生作用的靶基因。
本动物实验成功地建立癌症恶病质小鼠模型，并证实用参麦注射液进行干预后，荷C26鼠癌症恶病质状态得到改善，相对于空白对照组，能明显增加恶病质小鼠的摄食量和饮水量，减缓小鼠体重的下降，因此我们认为参麦注射液在临床癌症恶病质的姑息治疗中将有广阔的应用前景，但其作用机制值得进一步研究。
通过基因实验部分的结果分析发现，在癌症恶病质的发生、发展过程中有多个基因的参与，根据这些基因的相关文献查询，可以推断恶病质的相关机制和参麦注射液的作用靶点及机制。
本实验中参麦组与空白组对比得到的68条差异表达基因，其中多数是小鼠肌cDNA文库中的基因片段，另外包括代谢相关基因、免疫相关基因和极少量肿瘤相关基因。
其中比如：①TNNT3（fast skeletal muscle troponin T3）快反应骨骼肌肌钙蛋白T3基因［5］。此基因在骨骼肌中特异性表达，与肌肉和肌腱形成相关，其编码的肌钙蛋白（TnT）参与骨骼肌收缩。有文献报道人类和小鼠的快反应骨骼肌TnT在氨基酸的一级结构上约有93%的同源性。TnT的主要功能是参与Tn多聚体的形成并且结合原肌球蛋白（TM），当它们的结构或功能发生异常时，肌肉将会出现收缩障碍甚至发育障碍［6］。本实验中参麦组此基因呈明显上调趋势，有利于骨骼肌的良好发育。②Tcap基因仅在心肌与骨骼肌上高度表达，既往研究表明其突变可导致家族性肥厚性心肌病（HCM），是小于35岁的年轻人尤其是运动员发生猝死的重要原因之一［7］等等。目前有研究提示改善骨骼肌组织的退化是改善恶病质病人生活质量的重要措施［8］。在本实验中，参麦组此基因亦呈明显上调。这些结果都提示参麦注射液可能通过调控此类基因来改善恶病质小鼠的骨骼肌、心肌等正常形态，维持其正常功能。
从基因实验结果分析来看，我们认为①肌cDNA文库的基因片段可能引起小鼠肌肉组织的过度消耗，从肌肉蛋白降解的角度研究恶病质机制，有助于制定癌症病人恶病质治疗策略；②参麦注射液能通过调控部分代谢、免疫功能相关基因的表达，进而缓解colon26荷瘤小鼠癌症恶病质状态。但是明确其机制尚有待于进行测序或其它分子生物学方法进一步揭示。
【参考文献】
［1］沈静侠，姜达，康海立，等. 实验性癌性恶病质的发生及其干预［J］. 癌症进展杂志，2007，5(5):493.
［2］陈菊祥，范静平，应康，等. 基因表达谱芯片在胰腺癌相关基因筛选中的应用研究［J］. 第二军医大学学报，2000, 21(9):824826.
［3］崔慧娟，李佩文，李园. 肺癌恶病质的中医辨证分型［J］. 内蒙古中医药，2002，21(5):12.
［4］童康尔，尚官敏，葛丽娜，等. 参麦注射液辅助化疗治疗晚期非小细胞肺癌61例的临床观察［J］. 浙江中医药大学学报，2009，33(1):9596.
［5］Sung SS, Brassington AM, Krakowiak PQ, et al. Mutations in tnnt3 cause multiple congenital contractures: A second lucus for distal arthrogryposis type 2b［J］. Am J Hum Genet, 2003, 72(1):212214.
［6］朱小泉，李建新，姜淼，等. 远端关节弯曲的分子遗传学研究进展［J］. 国外医学遗传学分册，2005, 28(4):236239.
［7］向娟，张代富，王娟，等. 2个汉族肥厚型心肌病家系致病基因与TCAP基因的关系研究［J］. J Clin Cardiol(China), 2008, 24(1):1013.
［8］吴国豪. 癌症恶病质的发生机制与治疗对策［J］. Surg Concepts Pract，2008,13（5）：77. |
用户登录 
新用户注册 