1.2 实验材料

　　K562细胞株，为NK细胞敏感的靶细胞，购自上海中国科学院细胞库;CD3/CD16+ CD56单克隆抗体(Becton Dickinson公司)，PI碘化丙啶和PKH2试剂盒(Sigma公司)，RPMI1640培养基(GIBCO公司)，胎牛血清(四季青公司)。

　　1.3 细胞培养

　　K562细胞在含100 mL/L的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，37 ℃，体积分数5%CO2的条件下培养。待细胞数目增多至约80%，将细胞移至15 mL离心管中，1 000 r/min(r = 15 cm)离心3 min，弃上清液，加入新的培养液，重悬细胞，再将细胞悬液按所需要求的浓度分装入新的培养瓶中培养。

　　1.4 NK细胞毒性检测

　　1.4.1 原 理

　　选用K562细胞株作为NK细胞的靶细胞，将两者共同培养，双标记总的K562细胞以及死亡的K562细胞，K562细胞株与NK细胞共同培养2 h后，流式细胞术检测总的K562细胞及死亡的K562细胞数目，计算K562细胞的死亡率，判断NK细胞对K562细胞的杀伤作用，从而反映NK细胞毒性。

　　1.4.2 方 法

　　① 取处于对数生长期的K562细胞2 mL用不含血清的培养洗涤2次，用0.5 mL PKH稀释液重悬。另取PKH稀释液0.5 mL，加入2.5 μL PKH-2染色剂混匀，将此PKH溶液加入重悬后的K562细胞中，室温下反应2 min，取1 mL胎牛血清终止反应。然后再用含有100 mL/L胎牛血清的培养液洗涤3遍。洗涤后用含血清的培养液重悬细胞，将细胞浓度调整为1 × 105/mL备用。②抽取患者肘静脉血10 mL，用密度梯度离心法分离淋巴细胞，加PBS洗涤3次，弃上清，加入含100 mL/L胎牛血清的培养液重悬，通过细胞记数将细胞浓度调整到5 × 106/mL备用。③ 流式细胞检术检测：将分离并处理好的淋巴细胞及K562细胞分别以50：1和25：1的比例混合培养2 h。2 h后，在混合培养管中加入碘化丙啶(PI)对死

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