2.2  MTT法测定含药血清对SiHa细胞的抑制作用

    取对数生长期细胞制成单细胞悬液,计数,细胞浓度为3×104个细胞/mL,每孔100 μL,接种于96孔培养板中,设空白调零孔。在37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h后,用含2.5%胎牛血清的培养基分别稀释含药血清浓度为4%、8%,终体积为100 μL/孔。每种浓度设立6个平等对照孔,并设正常对照,置正常培养条件下培养。每24 h换液1 次,作用24、48、72 h后,弃去孔中培养液,每孔加入MTT 100 μL,反应4 h后,弃去每孔中的液体,加入DMSO,100 μL/孔,振荡10 min后,选择492 nm波长,在酶标仪上测定各孔吸光度(OD)值,记录结果。

　　2.3  Western blot法测定PTEN、MDM2、p53的含量

    用细胞刮子分别收集以4%浓度不同含药血清培养液作用72 h及对照组细胞的蛋白,冰浴1 h,然后4 ℃离心10 min。将上清移至预冷的EP管中,Bradford 法测定蛋白含量后,将剩余蛋白样品加入等体积上样缓冲液,沸水中煮5 min。制胶后上样,以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。分别将处理好的80 μg各组蛋白样品按照预定的顺序加入浓缩胶的上样孔内。经过电泳及转膜、封闭,将膜移入杂交袋中,加入用适当漂洗液稀释的一抗(PTEN为1︰200,p53为1︰200,MDM2为1︰250),封口,4 ℃孵育过夜,加入漂洗液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(PTEN为1︰2 000,p53为1︰5 000,MDM2为1︰2 000),振荡温育后感光、拍照。用Band Leader 3.0软件对扫描图像的目的条带进行灰度分析。

　　3  统计学方法

   采用SPSS12.0软件包进行统计学处理,数据以x±s表示,

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