1  实验材料

    正常大鼠肝BRL细胞,广州中山大学动物实验中心细胞库提供。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM、单克隆抗体、TUNEL检测试剂盒均购自Sigma公司。顺铂为齐鲁制药有限公司生产,批号0503007。加味小柴胡汤由中国人民解放军第153中心医院中药制剂室制备(原药材1 g/mL)。

　　2  实验方法

　　2.1  细胞分组及处理
 
　　取处于对数生长的BRL细胞随机分为4组(每组6瓶)。空白组：加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基；顺铂组：加入顺铂5 mg/L及10%胎牛血清的DMEM培养基；加味小柴胡汤大剂量组：加入顺铂5 mg/L、10%胎牛血清的DMEM培养基及加味小柴胡汤4 mg/mL；加味小柴胡汤小剂量组：加入顺铂5 mg/L、10%胎牛血清的DMEM培养基及加味小柴胡汤2 mg/mL。在37 ℃、0.5% CO2培养箱中培养48 h后,将胰蛋白酶消化的细胞制备成细胞混悬液。将收获的4组细胞分别制成细胞滴片(1×107/mL细胞混悬液滴加至预先处理过的硝酸纤维素膜和载玻片上)、细胞裂解液,并提取DNA和蛋白质,进行免疫组化检测。

　　2.2  完整细胞蛋白质斑点印迹

    采用间接酶标抗体免疫组化法：点膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的蛋白质,加0.5%吐温-20/TBS(Tris- HCl pH 7.2)封闭,加各自的一抗,0.01%吐温-20/TBS洗2次,加碱性磷酸酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG,加DAB/NBT-BCIP底物液进行免疫组化显色,以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　2.3  免疫细胞化学染色
 
　　4%多聚甲醛固定后的细胞标本入0.3%Triton X-100/PBS透化后,加10%正常羊血清,甩去多余血清,加1∶100稀释的各种一抗,置4 ℃湿盒内孵育过

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