|
作者：缪应业，刘新，李浩，乔卿华，侯林虎，刘小圆，郝晓柯
【摘要】 目的： 构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ（KDR）基因的shRNA表达载体，研究KDR基因沉默后对PC3细胞的增殖、生长的影响. 方法： 将合成的三对DNA正义链及反义链变性、退火，形成的双链DNA与pSilencerTM3.1H1 neo线性质粒用T4 DNA连接酶连接，构建pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2和Psilencer3.1KDR3三个siRNA表达载体. 经酶切及DNA测序鉴定后，采用脂质体介导的基因法转染PC3细胞，通过RTPCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验,检测KDR的表达变化,MTT法检测细胞生长速度的变化，流式细胞仪检测细胞周期的变化，以未转染和转染阴性对照质粒pSilencer3.1NC的PC3细胞为对照. 结果： 酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体. RTPCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验表明，pSilencer3.1KDR3有效地降解了PC3细胞中KDR基因的mRNA，下调蛋白表达;转染pSilencer3.1KDR3后PC3细胞生长速度明显变慢. 结果表明, pSilencer3.1KDR3组PC3细胞的G0/G1期百分率明显增高，而S期和G2M期的细胞减少,与其余组相比差异具有统计学意义(P<0.01). 而pSilencer3.1KDR1和pSilencer3.1KDR2无效. 结论： 成功构建针对KDR基因的siRNA表达载体，只有pSilencer3.1KDR3可有效地沉默KDR在前列腺癌细胞系PC3细胞中的表达，抑制PC3细胞的增殖.
【关键词】 RNA,小分子干扰;血管内皮生长因子受体;PC3细胞;前列腺肿瘤
0引言
血管内皮生长因子受体Ⅱ，又称激酶功能区受体(vascular endothelial growth factor Ⅱ, VEGFR2/kinase domain receptor, KDR)，其在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达，对于VEGF的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用. 研究表明，人前列腺癌细胞中有VEGF和KDR表达，存在VEGFKDR自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关［1-2］. 我们用pSilencerTM3.1H1 neo在前列腺癌细胞系PC3内表达针对KDR基因的短发卡状RNA(short hairpin small interfering RNA, shRNA), 阻断或降低细胞中KDR基因的表达， 探讨KDR基因沉默后对PC3细胞增殖、 生长的影响.
1材料和方法
1.1材料pSilencerTM3.1H1 neo质粒(美国Ambion公司)；LipofectamineTM2000转染试剂(美国Invitrogen公司)；PC3细胞株为本室保存；鼠抗人KDR mAb, 羊抗鼠二抗,DAB显色液(武汉博士德公司)；GAPDH内参及其mAb(上海康成生物有限公司)； pEGFPN2质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠.
1.2方法
1.2.1siRNA靶序列的设计及其表达载体构建根据siRNA设计原则［3］以及KDR(基因号AF063658)选取并针对KDR基因编码区（A：395～414 AACATGGAGTCGTGTACATTA；B：2969～2988 AAGCTCCTGAAGATCTGTATA；C：3906～3925 AAGCGGCTACCAGTCCGGATA），分别命名为（pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2, pSilencer3.1KDR3）,序列经同源分析后，由北京赛百胜公司合成. 按操作说明将合成的DNA变性、退火，形成的双链DNA与pSilencerTM3.1H1 neo线性质粒连接，转化DH5α感受态 [1] [2] [3] [4] 下一页 |
用户登录 
新用户注册 