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; 细胞毒性试验
取对数生长期细胞，按1×105/ml接种96孔板，24h后分组加入实验药物，每组6复孔，继续培养48h，加入CCK8，37℃孵育1h，酶标仪测OD值，计算细胞增殖抑制率，IC50，耐药倍数和逆转倍数，以抑制率不大于10%的药物浓度作为逆转浓度，耐药倍数=耐药细胞的IC50/敏感细胞IC50，逆转倍数=耐药细胞IC50/逆转后耐药细胞的IC50。
1.2.3 苦瓜蛋白对K562/A02细胞表面Pgp表达的影响
取对数生长期细胞，按1×105/ml接种于24孔板，分为对照组和苦瓜蛋白组，药物作用48h后，每个样本收集细胞2×105个细胞，PBS洗一次，重悬于100μlPBS液中，阴性对照组加入10μl的Mouse IgG2α，其余各组加10μl的Pgp
PE，室温避光孵育20min，PBS洗一次，加1%多聚甲醛250μl，FACS Calibur型流式细胞仪检测。
1.2.4 苦瓜蛋白对K562/A02细胞胞内药物浓度的影响：
取对数生长期细胞，按1×105/ml接种于24孔板，分为对照组和苦瓜蛋白组，药物作用24h后，加入10μg/ml的ADM孵育1h，PBS洗2次，加1%多聚甲醛250μl，流式细胞仪检测。
1.2.5 统计学分析
检验结果以x±s表示，样本均数比较采用t检验，P<0.05为统计学差异有显著性。
2 结果
2.1 苦瓜蛋白对K562/A02细胞毒性试验
苦瓜蛋白能够抑制K562/A02细胞生长，抑制作用随着药物剂量的增加而增强，呈明显的剂量依赖关系，见图1。48h的IC50为20.9μg/ml，2μg/ml 和5μg/ml的苦瓜蛋白对K562/A02的抑制率分别为4.2%和9.9%，我们选择以5μg/ml作为逆转剂量。
2.2 苦瓜蛋白对K562/A02药敏性的影响
K562/A02细胞对多种化疗药物耐药，耐药倍数从28.7～152.2，见表1。5μg/ml的苦瓜蛋白联合化疗药物共同作用于K562/A02细胞，能使细胞对多种化疗药物的IC50下降，逆转倍数分别为4.0～6.5倍，见表2。表1 K562/A02细胞的耐药程度（略）表2 苦瓜蛋白对K562/A02细胞耐药的逆转作用（略）
2.3 苦瓜蛋白对K562/A02细胞表面Pgp表达的影响
流式细胞仪检测显示，K562细胞不表达Pgp蛋白，K562/A02细胞表面 Pgp蛋白高表达，表达率为（94.88±3.37%），5μg/ml苦瓜蛋白处理后细胞表面Pgp表达下降明显，表达率为（80.33±2.30%）（n=3）（P<0.01），下降了14.55%，见图2。
2.4 苦瓜蛋白对K562/A02细胞内药物浓度的影响
流式细胞仪检测ADM蓄积水平结果显示：K562/A02平均荧光强度（30.69±2.16）与K562细胞的（219.16±8.23）相比，明显下降（P<0.01），流式图上表现波峰左移，细胞平均荧光强度明显减弱，说明耐药的K562/A02细胞内药物平均浓度降低。经5μg/ml苦瓜蛋白处理48h后，波峰右移，细胞平均荧光强度增强（60.47±2.97）（P<0.01），说明苦瓜蛋白增加了ADM在耐药白血病细胞内的蓄积，细胞的耐药性部分得到纠正（图3）。
3 讨论
白血病MDR是白血病化疗的一大障碍，克服白血病MDR，提高抗癌药物疗效已经成为白血病治疗急待解决的关键性的课题。体外被证实具有逆转耐药活性的化合物或生物制剂有很多，如环胞霉素、异博定等，但因它们对心、肾的毒性，使其临床应用收到限制。目前，国内外学者正积极寻找高效、低毒、逆转效果显著的肿瘤耐药逆转剂。苦瓜在中国、东南亚、土耳其等地均有广泛的栽种和药用历史，《本草 上一页 [1] [2] [3] 下一页 |
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