【摘要】  观察评价兔膝关节髌股关节面中心人工制造全层关节软骨缺损后，单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶移植到软骨缺损处对关节全层软骨缺损的修复效果，以探索关节软骨缺损修复简单有效的途径。［方法］新西兰大白兔27只随机分为A、B、C三组，A组关节软骨缺损处置入海藻酸钙凝胶，B组软骨缺损处不做任何处理，C组缺损处置入未经诱导的脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶，分别于术后第4、8、12周处死动物，通过大体、组织切片观察以及透射电镜等技术手段对修复效果进行观测，采用改良的Wakitani评分标准对修复组织进行评分，所得评分采用统计软件SPSS 11.5进行统计学分析。［结果］A、B组软骨缺损处为纤维组织状物填充，组织学切片可见为原纤维覆盖，C组软骨缺损处为类透明软骨组织填充，组织切片可见类软骨细胞及其周围的陷窝，电镜下可见细胞周围大量胶原纤维，C组在各个时期与A组、B组的评分比较差异都具有统计学意义(P<0.01)，示C组修复效果较其他两组为优。［结论］单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶可有效修复关节软骨全层缺损。

【关键词】  脂肪源干细胞 海藻酸钙 软骨

    Abstract: ［Objective］To evaluate the effect of not induced adipose derived stem cells(ADSCs)with calcium alginate healing full-thickness cartilage defects of rabbit knee after the model was made in center of femoral facies patellaris artificially, in order to find a simple and working way of articular cartilage defect restoration. ［Method］Twenty-seven New Zealand white rabbits were divided in to A, B, C groups randomly. Calcium alginate was transplanted to cartilage defect position of rabbits of group A, nothing for group B and calcium alginate with not induced ADSCs for group C. The animals were killed in 4th, 8th and 12th week later.Restored tissue was evaluated using naked eyes, histological section and transmission electron microscopy, score was given according to modified Wakitani grade standard. The total score was analyzed with statistic software SPSS 11.5. ［Result］Articular cartilage defects of the animal of groups A and B were filled with fibrous tissue which contains protofiber when it was checked using histological  section  and  microscopy.The  defect was filed with chondrocyte-like tissue .Chondrocyte-like cells surrounded with lacunes were observed in histological section. Plenty of collagen fibers around cells could be seen under transmission electron microscopy. Group C had a significant statistical difference compared with groups A and B (P<0.01) in each period which showed that group C got a better indication than other two groups.［Conclusion］Non-induced ADSCs with calcium alginate could repaire full-thickness cartilage defect of rabbit knee effectively.

    Key  words：ADSCs;  calcium alginate;  cartilage

    关节软骨的自身修复能力有限，其损伤后的修复一直是骨科界的难题之一。随着干细胞培养技术和组织工程技术的不断进步，多种组织工程方法被应用来探索软骨缺损治疗的可行性。2001年Zuk PA和Zhu Min［1］等从人脂肪组织悬液中第一次分离获得了多向分化干细胞。目前已证实脂肪组织来源干细胞（adipose derived stem cells,ADSCs）能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导分化［2］。本实验将单纯脂肪源干细胞复合藻酸钙凝胶载体填充修复兔膝关节全层软骨缺损，对实验结果进行观察分析，以探讨单纯脂肪源干细胞应用于关节软骨缺损修复的可行性，为关节软骨缺损修复探索简单有效的途径。

    1  材料和方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  主要仪器

    (1)超净工作台(JHT-DDC型，济南康宝净化设备有限公司)；(2)恒温孵育箱(Heraeus公司，德国)；(3)倒置相差显微镜(Nikon TE2000，日本)；(4)50 ml培养瓶(Corning公司，美国)；（5）低温高速离心机（Heraeus公司，德国）。

    1.1.2  主要试剂

    (1)DMEM培养基(Gibco公司，美国)；(2) Ⅰ型胶原酶(Sigma公司，美国)；(3)胰蛋白酶(上海华美公司，中国)；(4)胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；(5)D-Hank’s平衡盐（Sigma公司，美国）；（6）海藻酸钠（上海化学试剂站分装厂）；（7）氯化钙（上海生工生物工程有限公司）。

    2  实验方法

    2.1  脂肪源干细胞的获取、培养和鉴定

    将新西兰大白兔致死，无菌取双侧髂窝处脂肪组织约10 ml，用2倍体积D-Hank’s平衡盐液漂洗3遍，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.2%Ⅰ型胶原酶5 ml置于37℃温箱内消化0.5 h，低温高速离心机内1 000 r/min离心10 min弃上清，加入160 mmol/L NH4Cl约5 ml裂解红细胞10 min，筛网过滤，按8 000个/cm2种植于50 ml培养瓶中。培养瓶置于37℃体积分数为5%的CO2恒温孵育箱内。24 h后首次换液，去除残余红细胞及未贴壁细胞，后每隔2～3 d换液一次，融合达80%以上时传代，动物实验用细胞传至第4代。取部分2代细胞采用含10%FBS，0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L维生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素的DMEM诱导培养基向成骨细胞方向诱导。

    2.2  动物实验

    选择健康成年新西兰大白兔27只（购自山东鲁抗实验动物中心），体重2.5～3.5 kg，雌雄不限。编号后随机分成A、B、C 3组，每组9只，双膝均用于实验。10%水合氯醛耳缘静脉麻醉，取双侧膝关节内侧切口，将髌骨推向外侧，进入关节腔。分别于左右两侧用直径3.5 mm的钻头在髌股关节面中心造成全厚关节软骨缺损，深度以点状出血为止，约2.5 mm。A组：（18膝）缺损处单纯置入海藻酸钙凝胶。B组：（18膝），空白对照，缺损处不作任何处理。C组：（18膝），置入培养的脂肪源干细胞／海藻酸钙凝胶复合物，细胞最终浓度不低于2.0×106 ／ml。术毕兔清醒后，放置笼内自由活动，青霉素肌注连续5 d。

    2.3  检测方法

    2.3.1  细胞学检测

    生物学特性观察：观察细胞生长情况；取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色；另取部分向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色观察矿化结节，以证实所培养细胞有无干细胞特性。

    2.3.2  修复组织检测

    分别于术后4、8、12周处死动物，取材行大体、光镜组织学检查及电子显微镜下观察。(1)大体观察：膝关节滑膜有无充血水肿，关节囊有无粘连及修复组织的平整度、光泽度；(2)组织学检测：将标本脱钙、梯度酒精脱水，常规石蜡包埋、切片，HE染色和甲苯胺兰染色，进行光镜下组织学观察；（3）透射电镜观察：取12周修复组织，包埋后超薄切片，观察细胞及基质情况。

    2.4  统计学分析

    根据改良的Wakitani评分标准(见表1)采用盲法对各标本进行组织学评分。每一标本均有3人进行评分，取均数，所得评分结果应用SPSS 11.5统计软件进行多因素方差分析，与对照组比较采用Dunnett检验。表1  软骨缺损修复的组织学评分标准指标组织学表现评分

   3  结果

    3.1  脂肪源干细胞培养及诱导

    细胞于接种后24 h左右开始贴壁，细胞形态呈长梭形、三角形或多角形（图1）。细胞生长旺盛，3～4 d即可传代。取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色，苏木素复染细胞核，胞质未被油红O着色（图2），可见胞质中不含脂质，与脂肪谱系细胞无相关性。细胞培养7代后仍然增殖旺盛。向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色，可观察到形成的矿化结节有Ag+沉积而呈黑色（见图3），说明所培养的脂肪源干细胞有向成骨细胞分化的能力，有潜在的分化特性，具有干细胞特征。

    3.2  大体观察

    术后3～4 d动物轻度跛行，1周左右恢复正常。膝关节无红、肿、热等炎症现象。处死动物后见关节液清亮，关节囊无挛缩、粘连和新生物形成，滑膜无充血水肿，软骨无侵蚀，关节边缘无骨赘形成。

    术后4周，A、B组缺损处修复组织基本相同，缺损处未完全填充，修复组织为灰白色，基底部呈深红色，未见明显的炎性肉芽组织；C组缺损处亦未完全填充，但修复组织呈黄白色外观，表面粗糙；呈连绵的小丘状，与周围关节软骨分界清楚。

    术后8周，A、B组缺损处修复组织仍基本相同，缺损处未完全填充，但较前为多，修复组织仍为灰白色，表面粗糙，C组缺损处未完全填充，修复组织亦较以前为多，淡黄白色，表面变的光滑，有一定弹性，与周围正常软骨分界仍能辨认。

    术后第12周，A、B组缺损多完全填充，基本为纤维组织状物覆盖，表面与正常软骨齐平，深灰白色，质软，与周围正常软骨组织分界清楚，易剥离；C组缺损区修复组织色泽、质地同正常关节软骨，表面光滑，与周围软骨组织界面平齐并完全整合，结合紧密，不易剥离，与周围正常软骨组织界限模糊（图4）。

    3.3  组织学观察

    术后4周，A、B组见缺损区凹陷，有血凝块，被覆纤维组织，甲苯胺兰染色呈无异染性着色的纤维组织；C组见少量增殖的类似幼稚软骨细胞的细胞和较少的基质，细胞排列稍紊乱、不规则，细胞形态较小，周围无典型的陷窝样结构，甲苯胺兰染色异染性不明显，未见明显的多核炎性细胞。

    术后第8周，组织学与第4周相似，A、B组缺损区有纤维组织覆盖,有原纤维形成，呈波纹状走行，修复组织异染，少而不均匀；C组修复组织中可见到较多的类幼稚软骨细胞和基质，类软骨陷窝多见，细胞分布不均，呈明显的甲苯胺兰异染性着色。

    术后12周，A、B组修复组织多为较厚的原纤维，少数未曾完全填充，原纤维呈波纹状排列，未见软骨陷窝形成，甲苯胺兰染色少而不均匀；C组修复的类软骨组织和周围的正常软骨基本连成一片，类软骨细胞的形态似正常软骨细胞，但排列非柱状，较正常软骨细胞不规则，类软骨细胞周围可见类软骨陷窝（见图5）,未见炎性细胞浸润，甲苯胺兰着色较前均匀。

    3.4  透射电镜观察

    透射电镜下可见藻酸钙凝胶孔径大，交联较紧密、壁厚。A、B组4周可见到缺损处有较多的红细胞，8、12周缺损由纤维组织充填,多为层状排列的纤维组织，4周海藻酸钙部分降解，8周大部分降解；C组8、12周，修复组织中可见类幼稚软骨细胞，细胞呈圆或椭圆形，表面有不规则的突起，胞质中可见丰富扩张的粗面内质网和小而圆的线粒体，周围有较多的基质，周围基质内有纤细的纵横排列的胶原纤维(图6)。4周海藻酸钙部分降解，8周大部分降解。

    3.5  统计软件分析结果

    脂肪源干细胞／海藻酸钙凝胶复合物移植组得分与其他两组相比各时期有显著性差异(P<0.01)。进一步采用Dunnett检验，单纯移植海藻酸钙凝胶组与空白对照组之间各个时期无显著性差异(P>0.01)。（见表2）  表2  组织学评分时间

　　4讨论

    关节软骨是一种高分化的组织，其自行修复后一般为纤维组织或纤维软骨组织，形成透明软骨组织的能力有限。软骨细胞移植可形成透明软骨修复［3］，但缺点是软骨细胞本身是高分化细胞，体外培养增殖能力有限，自体移植其取材过程也会对受损的关节产生额外的损伤并需要二次手术，过程繁琐且费用昂贵［4］。

    组织工程技术为软骨缺损的修复带来了希望。骨髓基质干细胞的发现及其相关软骨组织工程应用研究较早，但骨髓基质干细胞取材、培养、诱导及移植相对较为麻烦，经济效果和临床效果也不理想。在体外培养条件下，脂肪源干细胞表现出与骨髓基质干细胞相类似的分化能力，而且具有易获得性、可迅速扩增及多向分化潜能等特点。本实验中，所培养的脂肪源干细胞，取材容易，培养、扩增效率较高，具有分化潜能，是优势较大的种子细胞。

    当脂肪源干细胞在体外用软骨培养基培养时，能够被诱导成软骨系，组织学和组织化学明显显示软骨细胞的表型。在软骨源分化过程中有特征性分子如II型胶原、软骨寡聚蛋白和软骨蛋白聚糖表达，体外诱导和体内形成的软骨低水平表达X型胶原和I型胶原［5］。12周左右，C组修复组织为类软骨组织，透射电镜照片可见大量基质，也观察到了类似组织学结果。

    Dragoo JL等［6］将脂肪源干细胞向软骨方向诱导后复合纤维凝胶移植到兔股骨髁全层软骨缺损处，结果显示修复效果较为满意。本实验的主旨是，由于不能判定诱导后植入，体内的真实生理环境是否会再次对经过诱导的细胞发生作用，与其通过人工的方法诱导后移植，增加了支出和过程的繁琐，不如省却人工模拟诱导的过程，将单纯细胞直接植入关节软骨缺损处，在转归过程利用真正的生理环境诱导分化，或许更能接近真实的修复。如果修复效果满意，将为软骨组织工程修复软骨缺损提供较为简单的方法。本实验中，脂肪源干细胞在植入前特意未进行软骨方向分化的诱导，而仅在证明其具有干细胞特性后，与藻酸钙凝胶混合后直接植入缺损处，最终所得的结果与Dragoo JL等的大体一致，这就提示，真实的生理环境诱导同人工诱导后植入差别不大。但因两种实验方法如造模及评价方法有些差别，是否的确如此，有待后继大规模动物对照实验进一步验证。  图1培养的脂肪源干细胞24 h后贴壁，态呈长梭形、三角形或多角形。倒置相差显微镜×200  图2培养的脂肪源干细胞爬片做油红0染色，苏木素复染细胞核，胞质未被油红0着色。右上角为阳性对照。苏木素油红0染色×200  图3成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色，形成的矿化结节有Ag+沉积而呈黑色。Von Kossa染色×100  图4术后12周大体观察，A、B组缺损多完全填充，为纤维组织状物基本覆盖，C组修复组织类正常关节软骨，与周围正常软骨组织界限模糊  图5术后12周，A、B组修复组织多为较厚的原纤维，少数未曾完全填充，C组修复的类软骨组织和周围的正常软骨基本连成一片，类软骨细胞的形态似正常软骨细胞。图中箭头示为原缺损处。 HE染色×200  图6术后12周，C组修复组织中可见类幼稚软骨细胞，周围有较多的基质，周围基质内有纤细的纵横排列的胶原纤维。透射电镜×4 200    藻酸钠是从海藻中提取的线状多糖成分，与软骨基质中的蛋白多糖结构相似［7］ 。藻酸盐与钙离子等二价阳离子交联后可形成网格状结构的多孔材料，常呈胶冻样凝胶，作为可注射性支架材料常用于填补组织缺损，并作为细胞载体运用于组织工程。藻酸钙凝胶在生物体内通过酶解生成葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸单体，对机体无毒性，无免疫源性，具有良好的生物相容性。有实验结果表明，脂肪源干细胞在藻酸盐支架中向软骨方向诱导后，其与脂肪源干细胞表现出良好的兼容性［8］。在本实验中，6周左右，藻酸钙凝胶即完全降解，组织切片未见明显炎性细胞浸润，藻酸钙植入后，4～6周左右时已大部分分解，提示其作为组织工程载体具有良好的应用前景。同时实验中也观察到，并非所有C组的动物软骨缺损处都达到完全修复，原因有待进一步探究。

    总之，脂肪组织在体内含量大，取材简单，利于脂肪源干细胞收集，又兼该细胞易于扩增，故脂肪源干细胞对于软骨缺损修复相关的软骨组织工程来说，是一种非常有希望的种子细胞。从脂肪源干细胞被发现并证明其具有多向分化潜能以来，随着时间的发展和相关研究的不断深入，脂肪源干细胞向软骨方向诱导技术已经成熟，其相关软骨组织工程研究的体内、体外实验效果都较为理想［6、8］，为软骨缺损的治疗提供了新的途径。但现有文献记载的相关动物实验中，其体内观察时间较短，远期修复效果有待进一步研究。本实验结果最终提示，单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶移植修复关节全层软骨缺损近期效果也较为理想，对于关节软骨缺损修复是一种很有希望的简单有效的组织工程方法。

【参考文献】
  ［2］ Strem BM , Hicok KC , Zhu M , et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells［J］. Keio J Med , 2005, 54:132-41 .

［3］ 翟喜成，王英振.Pluronic F-127负载同种异体软骨细胞修复兔全厚关节软骨缺损的实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2003,11,1053-1055.

［4］ Chanlalit C , Kasemkijwattanamd C , Varavit V . Autologous chondrocyte implantation for traumatic large cartilage defect.J Med Assoc Thai［J］.2007，90:1435-1442.

［5］ Lin Y , Luo E , Chen X , et al. Molecular and cellular characterization during chondrogenic differentiation of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and cartilage formation in vivo［J］ . J Cell Mol Med,2005,9:929-939.

［6］ Dragoo JL , Carlson G , McCornick F , et al. Healing full-thickness cartilage defects using adipose-derived stem cells［J］ . Tissue Eng ,2007,13:1615-1621.

［7］ Grancotti FG , Ruoslahti E . Integrin signaling ［J］ . Science , 1999 , 285: 1028-1033 .

［8］ Awad HA , Wickham MQ, Leddy HA , et al. Chondrogenic differentiation of adipose-derived adult stem cells in agarose, alginate, and gelatin scaffolds［J］. Biomaterials，2004，25:3211-3222.