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2000购自Invitrogen公司; RTPCR Kit购自promega公司; Taq DNA聚合酶和蛋白质Marker标准均购自大连宝生物工程有限公司 (TaKaRa公司); 限制性内切酶Xho Ⅰ、 Kpn Ⅰ、 T4 DNA连接酶购自NEB公司; DNA Marker标准购自上海捷瑞生物工程有限公司; 质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司; 凝胶纯化回收试剂盒购自北京天根科技生化有限公司; 羊抗大鼠CD36抗体和兔抗羊二抗购自Santa公司; ECL化学发光试剂盒购自Amersham biosciences公司; 其余一般化学试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank的大鼠CD36基因的序列（序列号为: NM_031561）设计合成引物, 引物序列为: 上游引物: 5′CCGCTCGAGATGGGCTGCGATCGGAAC3′, 下游引物: 5′GGGGTACCGTTTTTCCATTCTTAGATCTGCAAG3′, 引物5′端分别加入XhoⅠ和KpnⅠ酶切位点(框线内部分)。引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。
1.2.2 总RNA提取及RTPCR扩增 采用TRIzol一步法依照说明书提取NR8383细胞中的总RNA。取2 μg的RNA用MMLV反转录酶反转录成cDNA, 以此为模板, 进行PCR扩增CD36基因。反应体系: 10×buffer 2 μL, 2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL, 引物各0.4 μL, 5 U/μL Taq酶0.2 μL, ddH2O 15.2 μL, 模板1 μL, 计20 μL反应体系。扩增条件: 94℃ 30 s变性, 94℃ 30 s变性, 55℃ 30 s退火, 72℃ 1.5 min延伸; 循环30次; 最后72℃延伸6 min。PCR扩增产物电泳后, 回收目的片段。
1.2.3 pEGFPN1CD36重组质粒的构建与鉴定 用XhoⅠ、 KpnⅠ分别酶切pEGFP 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] 下一页 |
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