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N1和CD36基因片段, DNA凝胶回收试剂盒回收酶切片段。将回收片段按目的基因和载体浓度为1∶1, 反应体系10 μL, 在T4连接酶作用下4℃连接12 h, 转化DH5α感受态菌。经卡那霉素筛选, 挑取阳性克隆菌落, 摇菌提取质粒, 进行XhoⅠ、 KpnⅠ双酶切鉴定, 酶切鉴定正确的克隆送上海吉凯基因化学技术有限公司进行DNA测序, 将完全正确的质粒命名为pEGFPN1CD36。
1.2.4 pEGFPN1CD36重组质粒转染293T细胞 293T细胞用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培养, 转染前24 h传代, 接种入24孔板中, 每孔2×105个细胞, 待每孔细胞密度达到70%～80%时按Lipofectamine2000操作说明书进行质粒转染。培养48 h后, 荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况并收获细胞。
1.2.5 Western blot检测 将上述收获的细胞用冰PBS洗涤, 加入蛋白裂解液裂解, 4℃下12 000 g离心10 min, 取上清分装, 取适量稀释后进行蛋白定量。用上样缓冲液将各样品蛋白稀释至相同浓度, 100℃水浴5 min, 然后行SDSPAGE分析。电转移至PVDF膜上, 50 g/L脱脂奶粉室温振荡封闭1 h, 与1∶200稀释后的一抗4℃孵育过夜, PBST洗膜3次, 然后与1∶5 000稀释后二抗室温孵育2 h, ECL化学发光显色, X光片显影。
2 结果
2.1 CD36基因的RTPCR扩增 以总RNA为模板oligod（T）进行反转录, 以 CD36基因的上下游引物进行PCR扩增, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析得到约1 500 bp的条带, 与预期大小（1 436 bp）一致 (图1)。
图1 CD36基因RTPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳（略） M: DNA marker; 1: CD36 PCR扩增产物.
2.2 重组质粒pEGF 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] 下一页 |
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