VCC1真核表达载体的构建及肝癌细胞SMMC7721稳定转染株的建立及鉴定


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VCC1真核表达载体的构建及肝癌细胞SMMC7721稳定转染株的建立及鉴定

VCC1真核表达载体的构建及肝癌细胞SMMC7721稳定转染株的建立及鉴定

作者：牟霞, 陈瑶, 王穗海, 黄湘, 李明

【摘要】 　　目的: 构建pcDNA3.1(-)/VCC1真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法: 以SMMC7721细胞总RNA为模板, 通过RTPCR扩增VCC1基因编码区cDNA, 并将扩增的cDNA片段与pMD19T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后, 用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721, 经G418筛选并建立稳定的转染细胞株, 应用RTPCR及Western blot检测转染前后该细胞株VCC1基因的表达。结果: pcDNA3.1(-)/VCC1经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确, 真核表达载体构建成功; 经RTPCR及Western blot检测, 重组质粒转染株的VCC1基因的表达水平高于对照组, 证实VCC1基因稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论: 成功地建立了人基因VCC1的肝癌细胞SMMC7721稳定转染株, 为进一步研究VCC1的功能奠定了基础。

【关键词】 VCC1; 载体构建; 转染

　　VCC1（VEGF correlated chemokine 1）基因是新近发现的一个趋化因子, 被命名为VEGF相关的趋化因子1, 该基因编码119个氨基酸, 含有6个半胱氨酸残基, 其中4个分别位于2个CXC结构域中, 目前列为CXCL17。研究发现VCC1在乳腺癌、结肠癌中高表达, 并与血管形成相关, 在肿瘤的发生

　　1.2.4 T载体克隆对PCR产物进行割胶纯化, 将目的片段与pMD19T载体连接。连接反应体系为: Solution I 5 μL, pMD19T DNA 50 ng, PCR产物50 ng, ddH2O 3 μL, 置于16℃ 2 h后, 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受

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