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态, 在氨苄青霉素抗性平板上筛选生长, 挑取单克隆菌落。阳性克隆经酶切鉴定, 并命名为: pMD19T/VCC1。
1.2.5 真核表达载体pcDNA3.1(-)/VCC1的构建 用BamH I、 Xho I分别双酶切重组pMD19T/VCC1质粒及pcDNA3.1(-)空载体, 凝胶电泳后回收目的片段, 16℃连接10 h。连接、 转化, 方法同前。阳性克隆经酶切鉴定后测序(Invitrogen公司)。测序正确后扩大培养, 抽提重组质粒DNA。
1.2.6 细胞培养 SMMC7721细胞在含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中, 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度的孵箱中培养。
1.2.7 SMMC7721细胞的基因转染和筛选培养 将处于对数生长期的SMMC7721细胞以4×105个细胞/孔接种于6孔板中, 培养24 h, 使细胞达到80%～90%融合。用脂质体Lipofectamine2000介导空质粒及重组质粒转染细胞。转染前1 h先予细胞更换无血清培养基, 使细胞适应条件变更。并准备以下2种溶液, A液: 4 μg质粒DNA溶于150 μL无血清培养液中; B液: 4 μL脂质体溶于150 μL无血清培养液中。将A液与B液混匀, 室温孵育30 min, 以形成DNA脂质体复合体, 加入培养液中。培养8～14 h, 更换为完全培养液, 继续培养24 h, 次日于完全培养液中加入800 mg/L的G418继续进行培养, 2周后G418浓度改为400 mg/L维持筛选。用选择培养液培养4周后, 分离阳性克隆并扩大培养备用。
1.2.8 转染后VCC1表达的鉴定 分别以βactin和GADPH为内参照, 对VCC1基因在转染细胞内目的基因的mRNA及蛋白表达情况进行鉴定。分别收集稳定转染空载体重组质粒的细胞, 样品处理后进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳、 转膜、 TBST缓冲液洗膜、 50 g/L脱脂牛奶封闭。一抗为VCC1小鼠多抗, 二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG, ECL显色。
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