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结果
2.1 总RNA提取 用一步法成功提取SMMC7721总RNA, 总RNA电泳结果可见有5 S、 18 S和28 S 3条带。
2.2 RTPCR扩增产物的鉴定及真核表达载体的构建与鉴定 SMMC7721总RNA经RTPCR扩增, 扩增产物电泳结果可见在约360 bp处有一特异性扩增条带(图2), 与预期的扩增片段大小相符。将用BamH I、 Xho I双酶切重组质粒pMD18T/VCC1得到的目的基因插入pcDNA 3.1(-)空质粒, 获得pcDNA3.1(-)/VCC1真核表达质粒, 该质粒再经BamH I、 Xho I双酶切鉴定, 得到了360 bp的目的片段和约5 400 bp的载体片段（图1）, 送测序证实该质粒含有完全正确的VCC1 cDNA序列。 图1 RTPCR扩增产物及重组质粒pcDNA3.1(-)/VCC1双酶切鉴定（略）
M: DL 2 000 DNA marker; 1: pcDNA3.1(-); 2: pcDNA3.1(-)/VCC1; 3: VCC1 RTPCR扩增产物.
2.3 稳定表达株的筛选与鉴定 将pcDNA3.1(-)/VCC1质粒转染入人肝癌细胞系SMMC7721, 经4周选择性培养（400 mg/L G418）后, 得到了稳定表达目的基因mRNA的阳性细胞株。筛选后的VCC1稳定表达细胞经RTPCR及Western blot方法分析, 转染了pcDNA3.1(-)/VCC1的SMMC7721细胞与对照转染空载体及未转染的SMMC7721细胞相比, 三者的内参表达水平差别不大, 转染了pcDNA3.1(-)/VCC1的SMMC7721细胞扩增后的VCC1目的条带明显比对照转染空载体的亮, 说明重组子已成功转入SMMC7721细胞并得到表达, 而且转染了pcDNA3.1(-)/VCC1或空pcDNA3.1(-)质粒的SMMC7721细胞扩增后均得到1条大小为492 bp的条带(PGKneo), 而未转染的SMMC7721细胞没有扩增出该 上一页 [1] [2] [3] [4] [5] [6] 下一页 |
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