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作者：黄雪坤，梁景耀，刘新光，梁念慈
【摘要】 目的： 研究重组小鼠CK2α′亚基在大肠杆菌中的谷胱甘肽S转移酶(GST)融合表达和纯化后活性的测定. 方法： 将含有小鼠CK2α′ cDNA的pGEXGSTMCK2α′重组质粒转化大肠杆菌BL21，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，采用谷胱甘肽琼脂糖珠4B柱纯化，SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳银染鉴定. 将纯化的CK2α′与CK2β以不同的摩尔比混合，找到构成有完全活性的CK2全酶的最佳摩尔比. 用各种已知CK2底物鉴定重组小鼠CK2全酶的性质. 对纯化的CK2α′和重组CK2全酶进行动力学分析. 结果： 重组质粒转化表达菌经诱导后出现Mr约为38 ku过度表达蛋白，约占菌体总蛋白的31.1%. SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳银染显示纯化的蛋白为单一蛋白带. 纯化的CK2α′和β亚基等摩尔比混合可组成有完全活性的全酶. 重组CK2全酶的性质与天然CK2一致. 重组CK2全酶对ATP或GTP的米氏常数（Km）值均小于单独CK2α′，而最大反应速度(Vmax)值均大于单独CK2α′. 结论： 重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2α′亚基.
【关键词】 蛋白激酶类；小鼠;原核表达
0引言
蛋白激酶CK2是一种真核细胞中信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶. 它是由两个催化亚基(α或α′)和两个调节亚基(β)组成的不均一四聚体［1-2］，其在细胞生存、生长、增殖及凋亡过程中有很重要的功能. 由于该酶在细胞中的含量较少，提取纯化得到研究所需的量较为困难，因此，克隆并表达重组蛋白激酶CK2，对于深入研究该酶具有十分重要的意义. 我们将含小鼠CK2α′的pGEXGSTMCK2α′质粒进行诱导表达、纯化及测定其活性，以探讨重组蛋白激酶CK2α′是否具有生物活性.
1材料和方法
1.1材料大肠杆菌BL21(DE3)由卫生部武汉生物制品研究所引进；原核表达载体pGEXGSTMCK2α′由意大利Semplic博士、教授惠赠；胰蛋白胨和酵母提取物(英国Oxoid公司)；异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl βD1Thiogalactopyranoside，IPTG)(美国Sigma公司)；谷胱甘肽琼脂糖珠4B柱纯化试剂盒（瑞典Amersham Pharmacia公司）；丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（美国BioRad公司）；［γ32P］ ATP和［γ32P］ GTP(北京亚辉生物医学工程公司).
1.2方法
1.2.1蛋白激酶CK2α′细胞转化、原核表达和纯化将pGEXGSTMCK2α′转化感受态表达菌BL21,铺入含氨苄青霉素的LB琼脂平板上倒置培养,挑取单菌落加10 mL含Amp的LB培养基过夜振荡培养,次日按500 mL LB培养基加2.5 mL过夜培养菌,一次培养2000 mL,于37℃剧烈振荡培养,当A595 nm到达0.5时,加IPTG至终浓度为1 mmol/L进行诱导表达. 继续培养4 h后收获细菌,4000 g, 4℃离心10 min，沉淀用含0.2 mmol/L苯甲基磺酰氟的生理盐水洗涤2次,称湿重，超声破碎,30 000 g 4℃,离心15 min. 上清按谷胱甘肽琼脂糖珠4B操作说明书进行谷胱甘肽S转移酶(glutathione stransferase，GST)融合蛋白的柱纯化,凝血酶酶切.
1.2.2蛋白激酶CK2的活性测定根据文献［3］的方法稍加修改. 酶反应总体积为35 μL,反应混合液中含50 mmol/L TrisHCl, pH7.2, 150 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgCl2, 50 μmol/L ATP,［γ32P］ ATP或GTP 1.85×104 Bq(比活1.85×1017Bq/mol),去 [1] [2] [3] 下一页 |
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