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磷酸化酪蛋白2 g/L. 反应温度为30℃. 加15 μL层析收集的酶液启动酶反应,反应10 min后取30 μL点至直径2 cm的P81磷酸纤维素滤纸上终止反应,阴干,用85 mmol/L磷酸洗涤数次,最后用丙酮洗涤1次,80℃烤干后,加闪烁液于液闪仪计数. 每收集管做2个平行管测活(但酶性质实验则做3个平行管). 每分钟催化1 pmol［γ32P］ ATP或GTP上的32P转移到酪蛋白上所需的酶量为1个酶单位.
1.2.3蛋白定量和SDSPAGE蛋白质密度扫描蛋白定量按文献［4］的方法,以牛血清白蛋白作为标准进行定量. 表达的CK2α′亚基蛋白占菌体总蛋白的比例则用扫描仪扫描SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳图上相应的泳道，再使用Quanti Scan Demo软件对这泳道上的各种蛋白带进行半定量扫描，得出各种蛋白带的吸光度值（波浪线下的面积代表对应蛋白的质量）
，将目的蛋白的吸光度值除以各种蛋白带的总吸光度值，从而算出目的蛋白占菌体总蛋白的比例. 2结果
2.1小鼠蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的表达重组质粒pGEXGSTMCK2α′转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后可大量表达出一Mr约为64×103的新蛋白分子(图1,泳道2),与GST(Mr约为26×103)和小鼠CK2α′亚基(Mr约为38×103)的理论Mr总值相符. 而未用IPTG诱导的表达菌中CK2α的过度表达则不明显(图1,泳道1)，说明重组质粒在大肠杆菌中得到了特异高效表达. 图1,泳道2扫描结果表明，表达的融合型CK2α′蛋白占细菌总蛋白的31.1%左右(图2).
2.2纯化表达产物的分子量经谷胱甘肽琼脂糖珠4B 1步层析柱的分离纯化, SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳的银染结果表明,最终的纯化产物显示出Mr为38×103的单一条蛋白带(图3,泳道1),说明分离纯化是成功的.
2.3纯化的表达产物的性质
2.3.1蛋白激酶CK2全酶的构成为了观察原核表达纯化的小鼠CK2α′基能否与原核表达并经柱层析纯化的小鼠CK2β亚基［4］构成有活性的全酶,将这两种蛋白按不同的摩尔分子比在体外直接简单地混合,结果显示，加入小鼠纯化的重组CK2β亚基后CK2的活性明显增加, 在α′与β亚基等摩尔混合后其CK2活性是单独CKα′亚基活性的近8.7倍, 但再增加CK2β的量并不能导致CK2全酶活性的进一步增加(表1). 表1小鼠CK2β亚基对CK2α′亚基酶活性的激活
2.3.2重组小鼠CK2全酶的性质鉴定以酪蛋白、组蛋白和Poly(Glu:Tyr，4∶1)分别作为底物时测CK2全酶活性的结果显示，重组CK2全酶(CK2α′+CK2β)可以将去磷酸化的酪蛋白作为底物，而不能以组蛋白和TPK的底物Ploy(Glu:Tyr)作为底物. 以组蛋白和TPK的底物Ploy(Glu:Tyr)作为底物时，CK2全酶的活性不到以酪蛋白为底物时的20%.
在以酪蛋白为底物的同时，分别加入肝素、CK2特异性抑制剂5，6二氯1β呋喃糖苯并咪唑(DRB)，精胺，Ca2+，cAMP和cGMP后测定CK2全酶的活性的结果表明，重组CK2全酶的活性受肝素和DRB的抑制，能被精胺激活，而第二信使分子的Ca2+，cAMP和cGMP则对CK2的活性没有影响(表2).
2.3.3纯化的单独CK2α′亚基和CK2全酶(CK2α′＋CK2β)的动力学根据HanesWoolf作图法作出回归直线,得出的单独CK2α′亚基对ATP的米氏常数（michaelis constant, Km）值和最大反应速度(maximum velocity，Vmax）值分别为12.6 μmol/L和31.0 nkat；对GTP的Km值和Vmax值分别为31.7 μmol/L和28.7 nkat；CK2全酶对ATP的Km值和Vmax值分别为3.6 μmol/L和155.2 nkat；对GTP的Km值和Vmax值分别为4.3 μmol/L和60.0 nkat. 结果表明，CK2α′亚基和CK2全酶，均可利用GTP作为磷酸供体. 单独CK2α′亚基显示出对ATP的Km值小于对GTP， 上一页 [1] [2] [3] 下一页 |
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