| 原发性肝癌组织双向电泳技术优化 |
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0 g/L PMSF蛋白酶抑制剂)，裂解液(7 mmol/L尿素、2 mol/L硫脲、40 g/L CHAPS、100 mmol/L DTT、50 g/L(pH 3 ～ 10) IPG buffer，1 mmol /L PMSF)，超声裂解，15 ℃，离心10 min，取上清液，4 ℃，超速离心50 min，避开漂浮的脂质层，吸取离心上清4 ℃，再次离心50 min;取上清。Bradford法定量，分装后置-80 ℃保存。为充分去除样本中含有的杂质对等电聚焦的影响，我们采用了常用的三种蛋白沉淀方法，并对结果进行对比。①丙酮沉淀蛋白：加入4倍体积的冰丙酮使蛋白在-20 ℃沉淀至少2 h，4 ℃，离心15 min，用裂解液重溶。 ②三氯乙酸/丙酮沉淀：将三氯乙酸加到提取组织液中，终质量浓度为100 g/L，再加入4倍体积的冰丙酮使蛋白在-20 ℃沉淀至少2 h， 4 ℃离心15 min，最后再用冰丙酮清洗沉淀 ，去除三氯乙酸，用裂解液重溶。③Cleaning-up试剂盒沉淀蛋白：按Amersham公司的试剂盒说明书操作，用裂解液重溶。
1.2.2 等电聚焦电泳
分别采取目前常用两种上样方法：标准胶条槽上样(主动水化)及杯上样(被动水化)，并对结果进行比较分析。聚焦程序参考聚焦系统操作指南，同时利用软件对聚焦电压，电流进行检测，指导聚焦程序的调整，对不同聚焦方法进行比较分析(表1)。
1.2.3 第二向 SDS 电泳
(SDS-PAGE) 等电聚焦后的胶条分别以SDS平衡缓冲液(第一次加入100 mg/10 mL DTT，第二次加入250 mg/10 mL 碘乙酰胺)平衡两次，每次15 min。平衡后IPG胶条转移至电泳系统，用125 g/L的胶进行二向电泳，每块胶2 W，电泳50 min后改为每块胶15 W，电泳至溴酚蓝跑到凝胶底部。凝胶进行热考马斯亮兰染色。
1.2.4 凝胶图像采集与分析
染色后凝胶以Image scanner高密度扫描仪获取图像，利用ImageMaster软件对图像进行蛋白质斑点自动检测，然后手工删除假点，添加未检出的斑点，最后进行斑点匹配，分析。
2 结 果
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