3.2 聚焦程序

　　一向聚焦是双向电泳成功的关键，但好的聚焦程序是怎样摸索出来的呢?我们的经验是首先根据IEF的原则编排基础聚焦程序;再根据样本是否除盐决定低压聚焦的步骤及时间;最终的聚焦电压以5 ～ 8 kV为适，聚焦时间以10 h为基础进行调整。为了确保实验的重复性，最终聚焦要选择千伏结束。此外，在IEF过程中，利用软件对聚焦时的电压，电流进行实时监测，指导低压聚焦时间及步骤的调整。如电流过高，可在低电压处延长聚焦时间，利用低压达到除盐的效果。

　　3.3 上样方法

　　一向等电聚焦最常用的上样方法包括主动水化和被动水化。主动水化中，由于施加低电压有利于大分子蛋白的进入胶条[18]，可避免杯上样所产生的渗漏问题。被动水化法可任意调节上样位置，所以特别适合偏酸或偏碱蛋白的聚焦;最高电流可达75 ?滋A，因此对盐的耐受能力较强;同时具有避免蛋白在长时间的低电压水化过程中丢失等优点。但有些蛋白质的等电点靠近上样处，迁移率及溶解性降低，易沉淀在上样杯处，在二相电泳中表现为在上样处形成条纹状。实验时，应当根据样本类型和实验需要进行选择。本实验中，肝癌组织蛋白主要在pH 3 ～ 10之间，通过比较，我们选择主动水化。

　　蛋白质组学实验涉及的步骤很多，除了上述关键步骤，还有凝胶浓度，染色方法的选择等。实验时要根据感兴趣的蛋白的分子量选择凝胶浓度，常规选择125 g/L的凝聚;如果大分子质量的蛋白较多可以选择100 g/L的凝胶，相反，如果小分子质量的蛋白多，则选择150 g/L的凝胶。常用的染色方法有考染、胶体考染、银染、荧光染色等。一般上样量大于300 μg时可选择考染或胶体考染;上样量在100 ～ 300 μg选择银染;小于100 μg选择荧光染色。

　　我国肝癌组织蛋白质组学研究已有很多报道，但没有系统的总结双向电泳的方案。本研究充分结合肝癌组织成分特点及双向电泳的具体要求，从双向电泳的全过程进行探讨，通过实验获得理想的双向电泳图谱，形成了一套用于肝癌蛋白质组学研究的稳定可靠的双向电泳技术方案，供从事肝癌蛋白质组学研究人员参考，为进一步的蛋白质组学分析奠定基础。

【参考文献】
 

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