体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达


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体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达

体外siRNA抑制乳腺癌细胞株端粒逆转录酶基因的表达

作者：杨明峰，刘安定，郑专，陈建军，董学君

【摘要】 目的: 筛选能高效抑制乳腺癌细胞株MCF7和MDAMB453端粒逆转录酶（hTERT）基因表达的RNA干扰靶点，为乳腺癌的基因治疗提供依据. 方法: 构建针对hTERT基因的三种siRNA(siRNAhTERT1, siRNAhTERT2和siRNAhTERT3)，分别转导入乳腺癌细胞株MCF7和MDAMB453，同时以无同源性的siRNAhTERT4作阴性对照，含GFP基因的载体作阳性对照. 应用实时聚合酶链反应（realtime PCR）和Western Blot技术检测siRNA处理前后hTERT基因表达变化；MTT法检测细胞生长率；流式细胞术分析基因沉默对细胞凋亡的影响. 结果: 与阴性对照组相比，siRNAhTERT1，siRNAhTERT2和siRNAhTERT3三个实验组siRNA转染细胞后，hTERT的mRNA表达量下调至21%~40%，蛋白表达下降至50%，而三个实验组间差异无统计学意义（P>0.05）. 转染48 h 后，MCF7细胞抑制率分别为(57±4.3)%，（61±4.3）%，（65±6.0）%；MDAMB453细胞抑制率分别为（45±5.1）%，（45±4.1）%，（50±4.0）%. 流式细胞仪检测结果显示，细胞凋亡率有所增加，MCF7细胞为(18.90±0.11)%，(27.30±0.18)%，(27.00±0.16)%；MDAMB453细胞为(12.25±0.17)%，（17.80±0.19）%，（20.60±0.21）%. 结论：经siRNAhTERT1，siRNAhTERT2，siRNAhTERT3处理均可明显抑制MCF7和MDAMB453乳腺癌细胞的增殖及hTERT基因的表达，能够明显促进细胞的凋亡.

【关键词】 乳腺肿瘤；端粒酶逆转录酶；RNA干扰

0引言

端粒逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是端粒酶组成的亚单位，与肿瘤的发生、发展密切相关［1-2］. 新近的研究［3-4］表明，应用小片段干扰RNA（siRNA）沉默或下调hTERT表达，可降低端粒酶的活性，缩短端粒，从而使肿瘤细胞的生长受到抑制［5-6］. 不同siRNA转染效率的不同以及靶向hTERT的不同，siRNA对端粒酶活性抑制的程度也有所不同［7］. 本研究拟通过设计多对靶向hTERT基因的siRNA，转导入不同的乳腺癌细胞株，筛选出具有特异性下调hTERT基因表达的siRNA，旨在为乳腺癌的基因治疗提供依据.

1材料和方法

1.1材料乳腺癌MCF7和MDAMB453细胞株(上海细胞生物研究所)；LipofectamineTM2000转染试剂，总RNA提取试剂Trizol，realtime PCR试剂盒（大连TakaRa公司）；兔抗hTERT多克隆抗体，辣根酶标记羊抗兔IgG（美国Sigma公司）；CO2孵育箱（HEPA CLASS 100, 德国Thermo公司）；实时荧光定量(realtime) PCR仪（Light Cycle，美国Roche公司）；流式细胞仪（EPICS XL，美国Coulter Beckma公司）；蛋白电泳和电转仪（VE186，中国上海天能科技有限公司）.

1.2方法

1.2.1siRNA设计根据hTERT基因的DNA序列（GenBank accession NO.NM_198255.1）设计出互补的3对（siRNAhTERT1，siRNAhTERT2和siRNAhTERT3）siRNA序列［8］，siRNAhTERT4为无同源性的阴性对照序列. siRNA片段由广州锐博生物科技有限公司合成，其序列为：siRNAhTERT1正义链：5′GGAGCAGCUGCGGCCCUCCdTdT3′,反义链

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